呼吸道合胞病毒（RSV）特征描述实验室协议手册

呼吸道合胞病毒（RSV）特性鉴定实验室规程手册

引言

• 疾病概述
  • 病毒学: 呼吸道合胞病毒（RSV）属于副黏病毒科，是一种包膜病毒，具有负链单链RNA基因组。病毒基因组与核蛋白（N）紧密结合形成螺旋状核衣壳，并与磷酸蛋白（P）、大聚合酶蛋白（L）和M2-1蛋白组成的病毒复制复合物相关联。病毒包膜的内表面由基质蛋白（M）覆盖，并包含两种主要的跨膜糖蛋白：附着蛋白（G）和融合蛋白（F），以及第三种跨膜蛋白：小疏水蛋白（SH）。
  • 预防: 近年来，针对其前融合构象中的F蛋白的疫苗接种和被动免疫策略，在RSV预防方面取得了重大进展。预防婴儿重症RSV感染依赖于被动免疫，可通过母体疫苗接种或单次长效单克隆抗体注射实现。已有三种RSV疫苗在欧盟/欧洲经济区获得许可，供成人使用。

方法

• 本指南中介绍的协议是在法国北部的国家呼吸道病毒参考中心 (National Reference Centre for Respiratory Viruses) 和巴斯德研究所 (Institut Pasteur) 的肺炎病毒增殖分子机制单位 (M3P Unit) 内部研发的。
• 巴斯德研究所的RSV RT-qPCR方案已根据ISO 15189获得认证。
• RSV测序方案最初由巴斯德研究所的埃蒂安·西蒙-洛里埃博士开发。

实验室方案

• 生物安全: 呼吸道合胞病毒（RSV）被归类为第二类风险物质，如欧盟指令2019/1833（修订EC指令2000/54号附件一、三、五和六）所述。因此，根据国家法规和监管机构的要求，必须在其下进行生物安全水平2（BSL-2）条件的培养。
• 常用实验室设备和耗材: 列出了进行实验所需的实验室设备和耗材，包括吸管、移液管、滤芯、离心管、烧瓶、细胞培养板、低温管、RT-qPCR板、PCR板、无核酸酶水、无水乙醇、PBS 1X、胰蛋白酶-EDTA、MEM、胎牛血清、青霉素/链霉素、碳酸氢钠、漂白剂、台式离心机、PCR热循环仪、实时PCR热循环仪、水浴锅、冷冻容器、5%-CO2细胞培养箱、细胞培养用显微镜、液氮气相储存罐等。
• 呼吸道合胞病毒（RSV）的分子检测与测序
  • RSV 实时荧光定量PCR:
    • 材料和试剂: 总核酸提取试剂盒、实时RT-PCR试剂、引物和探针。
    • 方法: 采用Macherey-Nagel公司的NucleoSpin 8病毒核心试剂盒手动进行RNA提取。使用 Maxispan 8 病毒核心试剂盒进行 RNA 提取。采用水解探针检测和分型，包括呼吸道合胞病毒检测和呼吸道合胞病毒亚型分型。
    • 实时荧光定量PCR技术: 在热循环仪上按照表5中所述的热循环程序进行。
  • RSV基因测序:
    • 材料和试剂: dNTPs、RNA酶抑制剂。
    • 方法: 包括cDNA合成、聚合酶链式反应扩增、珠子上的扩增子纯化、扩增子测序、文库制备与测序。
• 细胞培养:
  • 材料和试剂: Minerva Biolabs 生产的 VenorGem OneStep 试剂盒、HEp-2 细胞、完全生长培养基、冷冻介质。
  • 方法: 包括HEp-2细胞传代、HEp-2细胞接种、支原体检测、细胞冷冻、细胞解冻。
• 病毒原液的产生:
  • 材料和试剂: 摇摆式摇床、Hep-2细胞、病毒稀释液、感染液、10倍RSV冷冻保存液。
  • 方法: 包括从临床PCR阳性样本中分离病毒、细胞板制备、病毒分离、收割、可选的病毒扩增步骤、RSV库存的生成、库存生产、收割、对病毒 stocks 进行质量检查。
• RSV plaque assays:
  • 材料和试剂: 感染培养基、HEp-2细胞、AVICEL RC591、病毒稀释液。
  • 方法: 包括呼吸道合胞病毒（RSV）蚀斑滴定法、通过蚀斑减少测定法检测抗体（尼尔维单抗）对呼吸道合胞病毒的的中和作用、通过蚀斑减少法检测人血清样本中针对RSV的中和抗体。