摘要
引言
呼吸道合胞病毒（RSV）是一种普遍存在且高度传染性的呼吸道病原体，可引起季节性流行，尤其在温带地区。大多数RSV感染表现为类似普通感冒的上呼吸道症状，但高风险人群（如婴儿、65岁及以上的老年人以及患有慢性疾病的患者）更容易发展为疾病的严重形式。全球范围内，每年有超过300万五岁以下儿童因RSV感染住院，并有12万例死亡。持续进行表型和基因组监测对于检测融合前F蛋白表位的突变、监测单克隆抗体敏感性潜在的降低以及追踪RSV-A和RSV-B基因型替代的动态至关重要。
病毒学
RSV属于副黏病毒科，是一种包膜病毒，具有负链单链RNA基因组。病毒基因组与核蛋白（N）紧密结合形成螺旋状核衣壳，该核衣壳与由磷酸蛋白（P）、大聚合酶蛋白（L）和M2-1蛋白组成的病毒复制复合物相关联。病毒包膜的内表面由基质蛋白（M）覆盖，并包含两种主要的跨膜糖蛋白：附着蛋白（G）和融合蛋白（F），以及第三种跨膜蛋白：小疏水蛋白（SH）。G蛋白通过与趋化因子CX3C受体1（CX3CR1）或硫酸软骨素蛋白聚糖的相互作用，负责呼吸道上皮细胞的初始粘附。F蛋白必须与其他细胞受体（如IGF1R和核糖核酸酶）相互作用，才能使病毒有效地结合到细胞表面。病毒粘附后，F蛋白发生显著的构象变化，从融合前状态转变为融合后状态，从而引发病毒膜与细胞膜之间的融合以及病毒核衣壳进入细胞质。RSV感染随后诱导形成包涵体，也称为病毒工厂，其中发生病毒复制和转录。新合成的病毒核糖核蛋白随后被转运到质膜，此前F、G和SH蛋白已被处理，出芽过程在此发生，产生能够启动新一轮感染周期的病毒颗粒。人类呼吸道合胞病毒（RSV）分为两个主要抗原亚组，RSV-A和RSV-B。这两种亚组每年都在人类群体中共同流行，其主导程度因季节和地理区域而异。在这些亚组中，不同的谱系会出现并持续共存很长时间，逐渐取代彼此。G蛋白表现出高度序列异质性，这可以改变病毒的抗原特性，并导致既往暴露后仍发生再感染。相比之下，F蛋白高度保守，尽管偶尔发生的替换可能会影响其前融合构象的稳定性或影响其对中和抗体的敏感性。
预防
近年来，通过针对其前融合构象中的F蛋白的疫苗接种和被动免疫策略，在RSV预防方面取得了重大进展。预防婴儿重症RSV感染依赖于被动免疫，可通过母体疫苗接种或单次长效单克隆抗体注射实现。在孕期使用非佐剂双价疫苗（Abrysvo）进行母体免疫，已在多个欧盟/欧洲经济区（EU/EA）国家获得批准，通过胎盘抗体转移在婴儿出生后的最初几个月内为其提供被动保护。两种靶向融合蛋白 prefusion 形式的长效单克隆抗体（Nirsevimab 和 Clesrovimab）通过单次肌肉注射可提供整季保护。已有三种RSV疫苗在欧盟/欧洲经济区获得许可，供成人使用。一种佐剂单价疫苗，可诱导针对两种RSV亚型的交叉中和抗体（Arexvy）；一种非佐剂二价疫苗（Abrysvo）；以及一种基于mRNA的疫苗（mRESVIA）。
方法
本手册中介绍的方案是在法国北部国家呼吸道病毒参考中心 (National Reference Centre for Respiratory Viruses) 和巴斯德研究所 (Institut Pasteur) 的 Pneumoviruses 复制分子机制研究小组 (M3P Unit) 内部研发的。此处复制的版本对应于其实验室目前常规或研究使用的标准操作规程。巴斯德研究所的RSV RT-qPCR方案已根据ISO 15189获得认证。RSV测序方案最初由巴斯德研究所的埃蒂安·西蒙-洛里埃博士开发。
实验室规程
生物安全
呼吸道合胞病毒（RSV）被归类为第2类风险物质，如欧盟指令2019/1833（修订EC指令2000/54号附件一、三、五和六）所述。因此，根据国家法规和监管机构的要求，必须在其下进行生物安全水平2（BSL-2）条件的培养。未感染的人II型上皮细胞（HEp-2）细胞的细胞培养同样需要BSL-2条件。
一般实验室设备和耗材
列出了进行实验所需的设备和耗材，包括吸管、移液器吸头、离心管、烧瓶、细胞培养板、低温管、RT-qPCR板、PCR板、无核酸酶水、无水乙醇、PBS、胰蛋白酶-EDTA、MEM、胎牛血清、青霉素/链霉素、碳酸氢钠、漂白剂、台式离心机、PCR热循环仪、实时PCR热循环仪、水浴锅、冷冻容器、5%-CO2细胞培养箱、细胞培养用显微镜、液氮气相储存罐等。
呼吸道合胞病毒（RSV）的分子检测与测序
RSV 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）可在从临床样本（鼻咽拭子、唾液或支气管肺泡灌洗液）、感染细胞培养物或病毒悬液中提取的病毒RNA上进行，用于诊断或定量目的。列出了进行RT-qPCR所需的材料和试剂，以及具体的方法步骤，包括RNA提取、反应混合物的制备、实时荧光定量PCR程序等。
RSV基因测序
RSV测序是否成功取决于病毒载量。根据经验，在RSV-A/B差异RT-qPCR检测中，Ct值低于28的样本能够成功测序。列出了进行RSV基因测序所需的材料和试剂，以及具体的方法步骤，包括cDNA合成、PCR扩增、扩增子纯化、扩增子测序、文库构建与测序等。
细胞培养
使用无菌材料制成的生物安全柜，以防止细菌污染。HEp-2细胞是分离和扩增呼吸道合胞病毒（RSV）的参考细胞系。列出了进行细胞培养所需的材料和试剂，以及具体的方法步骤，包括HEp-2细胞传代、HEp-2细胞接种、支原体检测、细胞冷冻、细胞解冻等。
病毒原液的制备
从临床PCR阳性样本中分离病毒，用于多种目的。列出了进行病毒原液制备所需的材料和试剂，以及具体的方法步骤，包括从临床样本中分离病毒、细胞板的制备、病毒分离、收割、可选的病毒扩增步骤、呼吸道合胞病毒（RSV）毒株的制备、病毒 stocks 的制备、对病毒 stocks 进行质量检查等。
RSV plaque assays
可以进行多种蚀斑测定来检测培养物的病毒效价或进行蚀斑减少实验。列出了进行RSV蚀斑测定所需的材料和试剂，以及具体的方法步骤，包括滴定、揭示等。
参考文献
列出了相关的参考文献。
