TRS 1060-附件6：生物分析方法验证和研究样品分析指南

生物分析方法验证和研究样本分析指南 关于任何进一步的信息或请求，请发送电子邮件至世界卫生组织（WHO）的药品规范和标准（NSP）团队，电子邮箱为nsp@who.int。 目录 缩写 310 1. 引言 3101.1 目标3101.2 背景3111.3 范围311 2.通用原则 312 2.1 方法开发 2.2 方法验证 2.2.1 完整验证 2.2.2部分验证 2.2.3 交叉验证 312312312313 3. 色谱法 3.1 参考标准 3.2 验证 3.2.1 选择性 3.2.2 特异性 3.2.3 矩阵效应 3.2.4 校准曲线和范围 3.2.5 精度和准确度 3.2.5.1 质量控制样品的制备 3.2.5.2 精度和准确度的评估 3.2.6 残留效应 3.2.7 稀释完整性 3.2.8稳定性 3.2.9 重新注入再现性 313314314315316316 3.3 研究样本分析3.3.1 分析运行3.3.2 分析运行接受标准3.3.3 校准范围3.3.4 研究样本的重新分析3.3.5 研究样本的再注入3.3.6 色谱图集成 4.配体结合测定 3283283284.1 关键试剂 4.1.1 参考标准 4.1.2 关键试剂 额外考虑事项 8. 文档 8.1 总结信息3498.2 验证和生物分析报告的文档350 3599. 词汇表 缩写 BA/BE生物利用度/生物等效性C最大浓度最大值CoA分析证书DMM干燥基质法电子通用技术文档（eCTD）电子通用技术文档EDTA乙二胺四乙酸IS内部标准ISR引起样本重新分析LBA配体结合分析LC液相色谱法下限定量（Low Limit of Quantitation）定量下限MRD最低必要稀释MS质谱学质量控制（Quality Control）质量管理标准操作程序（Standard Operating Procedure）标准操作程序ULOQ定量上限体积比/体积比体积在体积 1. 引言 1.1 目标 本指南旨在为化学和生物药物在生物基质中定量及分析研究样本的应用提供验证生物分析方法的建议。遵循本指南中阐述的原则将确保生物分析数据的质量和一致性，以支持化学和生物药物的开发和上市审批。 目标是对生物分析方法进行验证，以证明其适用于预定用途。如能提供适当的科学依据，则可接受对此指南中建议的变化。鼓励申请人与相关监管机构就以下问题进行咨询 当提出或采用替代方法时，方法验证方法的显著变化。 1.2 背景 化学和生物药物的代谢物在生物基质中的浓度测量是药物开发的重要方面。采用这些方法的研究结果有助于关于药物产品安全性和有效性的监管决策。因此，确保所使用的生物分析方法得到充分表征、适当验证并得到适当记录是至关重要的，以便为监管决策提供可靠数据。 1.3 范围 本指南描述了生物分析方法及研究样本分析的验证过程，这些方法预计将支持监管决策。本指南适用于用于测量生物样本中化学和生物药物及其代谢物浓度的生物分析方法，这些生物样本（例如，血液、血浆、血清、或其他体液或组织）是在遵守良好实验室实践原则的非临床毒代动力学研究中获得的，或作为临床研究的替身进行的非临床药代动力学研究，以及所有阶段的临床试验，包括比较生物利用度/生物等效性（BA/BE）研究和监管提交。本指南旨在促进根据3Rs原则（替代、减少、改进）进行动物研究时药物的开发，在适用的情况下。预期对旨在支持监管提交的初始基质进行全面方法验证。根据需要，应验证其他基质。 对于未提交给监管机构审批或未考虑用于关于安全性、有效性或标签的监管决策（例如，探索性研究）的研究，申请人可以选择支持他们自身内部决策的资质水平。 本指南中的信息适用于通过配体结合试验（LBA）和色谱法（如液相色谱法（LC）或气相色谱法）进行的定量分析，这些方法通常与质谱检测（MS）结合使用。 对于受良好实验室实践或良好临床实践规范约束的研究，研究样品的生化分析也应符合其要求。 生物标志物及其生物分析方法在免疫原性评估中的应用不在本指南的范围内。 2. 基本原则 2.1方法开发 生物分析方法的开发目的是定义该方法的设计、操作条件、限制和适用性，以确保该方法适用于其预定目的，并确保该方法已准备好进行验证。 在生物分析法开发之前或进行过程中，申请者建议在可行的情况下，了解目标分析物质的特性（例如，药物的物理化学属性、体外和体内的代谢、红细胞与浆液之间的分布偏好以及对蛋白质的结合），并且考虑任何可能适用的先前分析方法的各个方面。 方法开发涉及识别与量化分析物相关的程序和条件。方法开发可以包括以下生物分析元素的表征：参考标准、关键试剂、校准曲线、质量控制（QC）样品、选择性及特异性、灵敏度、准确性、精密度、回收率、分析物的稳定性以及最低所需稀释度（MRD）。 生物分析方法开发不需要广泛的记录保存或标注。一旦方法开发完成，生物分析方法验证可以证明该方法适用于研究样品的分析。 如果在分析非临床或临床研究样本时遇到问题，需要停止分析，则应记录方法及其理由的任何变更。 2.2 方法验证 2.2.1 完整验证 生物分析方法验证是确保分析性能的接受性以及分析结果可靠性的必要手段。生物分析方法被定义为用于在生物样品中测量分析物浓度的程序集。在为临床研究和适用非临床研究中的分析物量化建立生物分析方法时，应进行全面验证。当实施已在文献中报道的分析方法或在药物开发中将商业试剂盒改用于生物分析时，也应进行全面验证。通常，需要确定一种分析物，但在某些情况下，测定多于一种分析物可能是适当的。这可能涉及到两种不同的药物，包括其代谢物，或是药物的立体异构体或同分异构体。在这些情况下，验证和分析的基本原则适用于所有感兴趣的分析物。对于色谱方法，全面验证应包括以下要素，除非有其他合理理由：选择性、特异性、 矩阵效应，校准曲线（响应函数），范围（从定量下限（LLOQ）到定量上限（ULOQ）），准确度，精密度，残留，稀释完整性，稳定性及重新进样再现性。 对于LBAs，以下元素应当被评估，除非有其他理由进行说明：特异性、选择性、校准曲线（响应函数）、范围（LLOQ至ULOQ）、准确度、精密度、残留、稀释线性度及稳定性。如有必要，当适当的研究样本可用时，可以进行平行测试。 在验证过程中进行的评估应与样品分析工作流程相关。用于生物分析方法验证的矩阵应与研究样品的矩阵相同，包括抗凝剂和添加剂。在某些情况下，可能难以获得与研究样品相同的矩阵（例如，对于罕见的基质，如组织、脑脊液或胆汁，或者在测量游离药物的情况下）。在这种情况下，代用基质可以接受用于分析方法验证。 选择代理矩阵应当进行科学论证。在验证方法时，同种生物（如年龄、种族或性别）内部的矩阵差异通常不被视为不同。 一个具体的、详细的、书面形式的生物分析方法及验证程序应在事先建立。这种描述可能以协议、研究计划、报告、笔记本或标准操作程序（SOP）的形式出现。 2.2.2 部分验证 对已完全验证的分析方法进行的修改可以通过部分验证来评估。部分验证的范围可以从最少的仅一个准确度和精密度测定，到几乎接近完全验证（参见第7.1节）。部分验证的项目应根据对方法进行修改的范围和性质来确定。 2.2.3 交叉验证 交叉验证是必须的，以证明当涉及多种生物分析方法或多个生物分析实验室时，所报告的数据如何相互关联（参阅第7.2节）。 3. 色谱法 3.1参考标准 在方法验证和分析研究样本期间，使用参考标准的溶液对空白生物基质进行加标以制备校准标准和质量控制样品。校准标准和质量控制 样品应从不同的储存溶液中制备。然而，只要已验证储存溶液的准确制备和稳定性，校准标准和质量控制（QC）样品可以来自相同的储存溶液。 应在样品处理过程中，向所有校准标准、质控样品和研究样品中添加合适的内部标准（IS）。缺乏IS的情况应予以合理说明。 重要的是，参照标准应具有良好的特征描述，并确保参照标准的质量（例如，纯度或身份）以及IS的适用性，因为质量会影响分析结果，从而影响研究数据。在验证和研究样本分析期间使用的参照标准应来自一个真实且可追溯的来源。参照标准应与待测物相同。如果不可能做到，应使用已知质量的固定形式（例如，盐或水合物）。 适合的参考标准包括药典标准、市售标准或内部或外部组织制备的充分表征的标准。一份分析证书（CoA）或同等替代品是必需的，以确保质量并提供有关参考标准纯度、储存条件、复检或有效期和批次号的信息。 合格分析报告（CoA）对于IS不是必需的，只要证明了其适用性，例如，显示物质本身及其杂质缺乏分析干扰，但应记录身份和纯度的证据。 当使用MS检测时，尽可能推荐使用稳定的同位素标记的分析物作为内标。然而，至关重要的是标记的标样必须具有高同位素纯度，且不能发生同位素交换反应。应检查未标记分析物的存在，并在方法验证过程中评估检测到未标记分析物时的潜在影响。 股票和工作溶液应仅从在稳定性期内（如CoA中所述，无论是到期日期还是复试日期）的参考标准中制备。 3.2 验证 3.2.1 选择性 选择性是指分析方法在空白生物基质中存在潜在干扰物质的情况下，区分和测量分析物的能力。 应使用至少来自六个独立来源或批次的空白样品（未经分析物或内标添加的基质样品）进行选择性评估（来自非溶血和非脂血的批次）。在罕见基质的情况下，使用较少来源可能也是可接受的。还应对内标的选择性进行评估。 选择性评价应证明在空白样品中分析物或内标在保留时间处没有观察到由干扰成分引起的显著响应。干扰成分引起的响应不应超过在LLOQ处的分析物响应的20%，并且每个基质样品中在LLOQ样品中的内标响应不应超过5%。 为了研究脂血基质中的选择性，至少应该使用一种基质来源。为了科学上有意义，用于这些测试的基质应尽可能代表预期的研究样本。应从供体处获得具有异常高甘油三酯水平的天然脂血基质。虽然建议使用供体的脂血基质，但如果难以获得，则可以将甘油三酯添加到基质中，即使这可能不代表研究样本。然而，如果药物影响脂质代谢或目标患者群体是高脂血症患者，则不建议使用添加样本。除非药物影响脂质代谢或在特定高脂血症动物品系中给药，否则此评估对于非临床研究是不必要的。 对于裂解矩阵中选择性的研究，应使用至少一种基质来源。裂解基质应通过向裂解全血中加入基质（至少为体积体积的2%）来获得，以生成一个可以明显检测到的裂解样本。 如果在这些样品中（例如，脂血或溶血样品）未显示选择性，则生物分析方法将无法用于分析这些类型的样品。可能需要开展额外的实验，如部分验证，以解决如何避免在样品分析中遇到这种限制的问题。 3.2.2特异性 特异性是指生物分析方法检测分析物并将其与其他物质（包括其相关物质）区分开的能力，例如，与分析物在结构上相似的物质、代谢物、同分异构体、杂质、在样品制备过程中形成的降解产物，或者预期将在治疗有意指征的患者时使用的伴随用药。 如果预计在目标生物基质中存在相关物质，应在方法验证期间或替代地，在给药前研究样本中评估这些物质的影响。在基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法中，为了评估这些物质的影响，评估可能包括比较潜在的干扰相关物质的分子量与分析物，以及将相关物质从分析物中分离的色谱分离。 检测到的并归因于干扰成分的响应不应超过LLOQ处的分析物响应的20%，也不应超过LLOQ样品中内标（IS）响应的5%。 分析过程中代谢物在连续步骤（包括提取程序或质谱源）反向转化为母体分析物的可能性也应予以评估（例如，可能不稳定的代谢物，如酯分析物到酯/酸性代谢物，不稳定的N-氧化物或葡萄糖苷代谢物，内酯环结构）。公认的是，在新化学实体药物开发的早期阶段，当代谢尚未评估时，这种评估可能无法进行。然而，预计应研究这一问题，并在必要时进行部分验证。应建立反向转化的程度（如果有的话），并在生物分析报告中讨论其对研究结果的影响。当所有代谢物都已知时，如果没有反向转化，可以无实验数据地证明。如果分析物和代谢物共流出，则应通过实验评估特异性。 3.