第 252 号试验: 体内快速雌激素活性 (REACTIV) 测定

经合组织/OCDE 252通过:25 June 2024 经合组织化学品试验指南 体内雌激素活性快速测定(REACTIV) INTRODUCTION 1.体内快速雌激素活性(REACTIV)测试指南描述了 2.日本medaka鱼O. latipes是为REACTIV选择的测试物种分析。该物种在许多经过验证的OECD测试指南中使用，包括：OECD TG 203（鱼类急性毒性试验；（3）），OECD TG 210（鱼类早期生命阶段毒性试验；（4））， TG 234（鱼类性发育测试；（8））；OECD TG 240（Medaka延长一代 繁殖测试；（9））；OECD TG 251（快速雄激素破坏活动报告者；（10））和 雄激素筛查（JAMASA）；（11））。 3.REACTIV分析是基于转录的，并使用转基因medaka系harbouring the chgh - gfp generic construct. The chgh - gfp transmission lines used in the REACTIV测定含有2.047 kb的medaka绒毛原蛋白H基因启动子的上游绿色荧光蛋白(GFP)编码序列的起始密码子驱动表达。chgh - gfp转基因在medaka的肝脏中表达，以响应雌激素的激活轴信号。在心脏的一些细胞中也存在GFP的非诱导型异位表达和头部处于胚胎生命阶段。这允许视觉确认鱼苗是转基因的。 4.转基因中存在的启动子区域已显示包含推定的雌激素反应元件（ERE）和转基因的表达已被证明在雌激素受体(ER)激动剂、拮抗剂和化合物诱导或抑制类固醇生成酶(12)(13)(1). 5.绒毛膜生成素基因，很像卵黄蛋白，是鱼类产卵所必需的。他们的表达在响应雌激素轴信号传导时上调。作为一个终末步骤，他们的表达和GFP在ggfp medaka系中的表达代表整体或净 © OECD, (2024) 经合组织/OCDE内源性和外源性因素改变雌激素轴信号的作用(改变 在激素的生产，运输，代谢和排泄以及激活和抑制ER)。6.在进行REACTIV测定之前，实验室应验证其具有当地有关转基因生物使用的法规可能要求的认证。应使用用于测试的chgh - gfp转基因品系进行REACTIV测定指南开发，可在市场上获得(OECD，REACTIV测定验证report). The use of another转基因系based on the Choriogenin H promotor driving theGFP或其他报告基因的表达需要完整的OECD验证以适应验证标准、统计分析和荧光阈值以及决策逻辑。因此，其他转基因品系不能被认为是适当的实施REACTIV测定。7.本指南提案基于国际实验室间验证研究从2020年到2022年进行（14）。该测试已在六个实验室中验证，其中有18个mono -组成测试物质。其中：四个在六个实验室中进行了测试；五分之六实验室；四个实验室中的另外两个；三个实验室中的另一个；另外四个两个实验室和一个实验室。8.测量的终点是eleutheroemederes肝脏中的荧光。非常低水平的荧光被观察到在未暴露的eleutheroemes。当转录的遗传构建体在化学暴露后被激活或抑制，eleuthero胚表达或多或少的GFP，因此发出或多或少的荧光。暴露于测试化学品的eleutheroembores的荧光与未暴露于测试化学物质的胚胎。9.在存在和不存在30μg / L睾酮（T）的情况下测试测试化学品。在这个雌性胚胎生命阶段，循环雌激素和雄激素水平仍然很低。因此，循环T将主要是外源性的，而不是内源性的。而内源性雌二醇和T是非常低的，在这个阶段，CYP19（芳香化酶）仍然表达和eleutheroembores因此有能力将外源T转化为雌二醇。将T添加到测试培养基中允许检测影响T可用性或拮抗ER的物质，因为它在体内代谢通过细胞色素P450酶芳香化酶（CYP19）转化为雌二醇。使用的T的浓度根据经验确定共治疗的浓度（30 μ g / L）为诱导荧光统计学显著增加的最低浓度的T24 h暴露。T和被测组合诱导的差异基因表达因此，化学是一种实验室诱导的现象，在没有外源T在这个发育阶段，因此只是指示测试的能力诱导(抗)雌激素活性的项目，目前不被认为是预测生理结果。然而，它确实允许检测到作用机制在没有芳香化雄激素的情况下，如芳香化酶的改变，不会被揭示活动或ER拮抗作用。 初步考虑和限制 10.该测定法测量化学物质激活或抑制转录的能力chgh - gfp遗传构建体，无论是直接通过与ER结合还是修饰雌激素对ER，或间接通过改变可用来激活雌激素的量 经合组织/OCDEER和因此chgh - gfp构建体的转录。迄今为止，REACTIV测定已经 显示检测通过各种作用机制起作用的化学物质，包括：ER激动剂（例如雌二醇，雌酮）；选择性雌激素反应调节剂（例如他莫昔芬）；调节剂类固醇生成，包括芳香酶抑制剂（例如阿那曲唑和法德罗唑），芳香化酶转录抑制剂(例如丙氯胺)和芳香化酶转录诱导剂(例如雌激素)和需要代谢激活的化学物质(例如T) (OECD，REACTIV测定验证报告；（1）。此外，REACTIV测定法可能检测雌激素的调节剂通过与血浆结合蛋白的相互作用进行转运。REACTIV测定不能区分在不同的作用机制之间，但提供了化学品是否起作用的信息作为O. latipes eleuthero胚中雌激素轴的整体激活剂或抑制剂。11.由于chgh - gfp构建体的转录需要ER对绒毛膜生成素H启动子，通过替代信号影响ER信号传导的化学物质不会导致ER和DNA之间相互作用改变的途径(即“非基因组动作”）预计不会通过REACTIV测定检测到。这包括快速通过膜定位ER的雌激素信号。非基因组的相对突出目前对ER信号传导知之甚少。12.许多出版物都支持这样的观点，即medaka的早期生命阶段是代谢能力强，尽管目前的数据不足以得出结论代谢能力。肝脏在受精后第2天和第4天之间形成，在孵化和开始REACTIV测定之前大约7天(Iwamatsu, 2004)。之前到DPF1的肝脏形成，已经证明胚胎medaka可以转化苯并（a）芘（BaP）转化为包括BaP - 3 -葡糖苷酸在内的代谢物，证明了UDP -葡萄糖醛酸基转移酶(15)强细胞色素P450（CYP）1A活性也已被鉴定在DPH1中的肝脏，g和其他器官中(16)。此外，CYP3A40表达在整个medaka发育过程中，CYP3A38（胚胎后形式）被表达从DPH1(17)。孵化前的medaka暴露于吡虫啉导致检测到羟基和孵化时的烯烃代谢物，表明存在CYP3A4活性（18）（19）（20）。在此外，还检测到脲-吡虫啉，提示CYP1A2，CYP2B6，CYP2D6的活性和/或CYP2E1。类固醇生成酶P450芳香化酶，11β-羟化酶的表达和3β-羟基类固醇脱氢酶在孵化前已被检测到(21)。事实上，孵化前medaka已被提出作为研究合成代谢类固醇和代谢的模型已被证明在暴露于美地二烯酮时会产生许多代谢物包括人类产生的三种单羟基化代谢物和一种还原代谢物(22).13.本测试指南依赖于荧光的定量在整个eleutheroemboreme。本测试指南的限制是它不应用于测试化学品在500和550 nm之间发射荧光(λEM= 500 - 550 nm)在波长下激发时在450和500 nm之间(λEX= 450 - 500 nm）并在eleuthero胚内发荧光。测试具有这两种性质的化学物质可能会诱导荧光，这可以解释为作为GFP信号，导致测试化学物质被错误地识别为对雌激素有活性轴。§ 31中提出了一个简单的协议来确定测试化学品是否发射荧光。该方案需要使用野生型O. latipes eleutheroembores。14.REACTIV分析不应用于测试落在其外部的化学物质适用性领域。REACTIV测定适用于测试非挥发性物质。当考虑到测试混合物或困难的测试化学品，应预先考虑这样的测试是否会产生科学可靠的结果。如果使用测试指南 经合组织/OCDE用于测试混合物，UVCB (未知或可变成分的物质，复杂 反应产物或生物材料)或多成分物质，其组成应，尽可能地表征，例如，通过其成分的化学特性，它们的定量发生及其特定于物质的特性。关于给出了对困难测试化学品(例如混合物、UVCB或多成分物质)的测试第23号指导文件(23). 试验原理 一般实验设计 15.一般的实验设计需要暴露DPH0转基因gh - gfp medaka在六孔板中的eleutheroembores到存在的测试化学品（“加标模式”）和不存在（“未加标模式”）与30 μ g / L T的共同处理。三个独立运行应对于每个测定进行。建议使用至少五个浓度加强制性对照(试验培养基对照和/或溶剂对照，488 ng / L 17α-炔雌醇[EE2]对照，T对照，加标组的诱导对照和抑制对照spiked groups) per run. The test uses eight eleutheroembores distributed in a single well per test条件(测试浓度和对照，T对照除外，其中包括两个孔八个eleutheroembores），在静态方案下。所有六个孔都可以在每个六孔板上使用。有两个不同的测试或对照组占据相同的板是没有问题的挥发性化学物质除外，但应注意避免交叉污染。使用五个测试浓度和强制性对照，分三个运行进行，REACTIV测定每次运行使用128个eleutheroembores (136，如果测试培养基和溶剂对照组是两者都需要)，因此，构成一个实验（参见图1和§ 17）或408，如果测试介质和溶剂对照组都是required. The exposure duration is 24 h with a 14: 10 light: dark cycle. The assay measures GFP通过荧光成像转化转基因gh - gfp eleutheroembores的荧光将荧光信号转换为数字格式。可以找到测试条件的详细概述在附件2中。 控件 16.REACTIV检测需要以下强制性对照组，所有这些组，除了试验介质对照,应具有相同浓度的有机溶剂(如果使用)。同样，所有暴露于测试化学品的组应暴露于相同浓度的溶剂作为对照组。 a.测试培养基和/或溶剂对照:将具有8个生物体的1个孔暴露于测试培养基。该对照定义了测试介质中的基础荧光水平。如果溶剂是使用，然后将该组暴露于测试介质加上相同使用的溶剂concentration as all other groups. In cases where a solvent is used with no history数据可用，需要测试培养基和溶剂对照组。 经合组织/OCDEb。EE2 488 ng / L：1孔与8种生物接触488 ng / L的EE2。此对照 建立了一个接近最大的荧光可观察到的大多数机制action. It is also equivalent to the least concentration of EE2 inducing a statistically在已发布的21天medaka测定中，繁殖力显着降低(24). c. T 30 μ g / L：两个具有8个生物体/孔的孔暴露于30 μ g / L的T。此对照用于通过T向雌二醇的内源性转化诱导雌激素轴信号传导。以“T尖峰模式”诱导雌激素信号允许抑制雌激素轴通过ER拮抗，芳香化酶抑制或抑制芳香化酶的信号传导要检测的表达。它还允许通过以下方式诱导雌激素轴信号如芳香酶表达增加等机制有待检测。数据来自两个合并用于该对照的孔,以增加平均荧光值的置信度。这是必需的，因为该对照组的变异性高于测试培养基或溶剂对照组，因为睾酮处理诱导荧光。 d.加标组的诱导控制：1孔与8个生物体暴露于64 ng / L的EE2加上30 μ g / L的T。该对照组证实