第 493 号试验: 人重组雌激素受体 (hrER) 体外试验以检测具有 ER 结合亲和力的化学物质的基于性能的试验指南

基于性能的人重组雌激素测试指南受体(hrER)体外检测与ER结合的化学物质亲和力 经合组织/OCDE 493通过：2018年7月18日更正：2024年6月25日 经合组织化学品试验指南 基于性能的人重组雌激素受体（hrER）体外测定检测具有ER结合亲和力的化学物质的测试指南 一般介绍 基于性能的测试指南 1.该基于性能的测试指南(PBTG)描述了用于人重组体外测定以检测具有雌激素受体结合亲和力的物质(hrER结合测定)的方法。它包括两种用于鉴定雌激素受体的机械和功能相似的测试方法（i。Procedres.ERα）粘合剂，并应根据OECD指导文件（GD）中关于危险评估新的或更新的测试方法的验证和国际接受的验证原则（1），促进新的类似或修改的测试方法的开发。提供本PBTG基础的经过充分验证的参考测试方法（附件2和附件3）为： •使用全长人重组ERα（2）的Freyberger - Wilson（FW）体外雌激素受体（ER）结合测定•使用人重组配体结合结构域蛋白的化学评价和研究所(CERI)体外雌激素受体结合测定(2)。 性能标准（PS）（3）可用于促进相同危险终点的类似测试方法的开发和验证，并允许及时修改此PBTG，以便可以将新的类似测试方法添加到更新的PBTG中。但是，只有在审查并同意满足性能标准后，才会添加类似的测试方法。本测试指南中包含的测试方法可以不加区分地用于满足各国对雌激素受体结合测试结果的要求，同时受益于数据的相互接受。 PBTG中包含的测试方法的背景和原理 2.经合组织于1998年发起了一项高度优先的活动，以修订现有的测试准则，并制定新的测试准则，以筛选和测试潜在的内分泌干扰化学品。2012年修订了经合组织关于测试和评估潜在内分泌干扰化学品的概念框架。原始和修订的CFs作为附件包含在《关于评估内分泌干扰化学品的标准化测试指南的指导文件》(4)中。CF包括五个级别,每个级别对应于生物复杂性的不同级别。在该PBTG中描述的ER结合测定是水平2,其包括提供关于选择的内分泌机制/途径的数据的“体外测定”。该PBTG用于体外受体结合测试方法，旨在鉴定人雌激素受体α（ER。 ).3.已经清楚地证明了体外ER结合测定与生物学功能的相关性。ER结合测定被设计用于鉴定具有破坏雌激素途径的潜力的化学物质,并且在过去的二十年中已经被广泛地用于表征ER组织分布以及鉴定ER激动剂/拮抗剂。这些测定反映了配体-受体相互作用，这是雌激素信号传导途径的初始步骤，对于所有脊椎动物的生殖功能至关重要。 © OECD（2024） 您可以根据http: / / www. oecd. org / termsandconditions /上提供的条款和条件自由使用本材料 经合组织/ OCDE4.雌激素与ER的相互作用可影响雌激素控制基因的转录并诱导非基因组效应，这可导致细胞过程的诱导或抑制，包括细胞增殖、正常胎儿发育和生殖功能所必需的那些过程(5) (6) (7)。正常雌激素系统的扰动可能会对正常发育（个体发育），生殖健康和生殖系统的完整性产生不利影响。不适当的ER信号传导可导致诸如激素依赖性癌症的风险增加、生育能力受损以及胎儿生长和发育改变等效应(8)。 5.体外结合测定法基于物质与调节基因转录的特定受体配体结合位点的直接相互作用。人重组雌激素受体α（hrERα）结合测定法的关键组成部分测量放射性标记的配体（[3H] 17β-雌二醇）在增加浓度的测试化学品存在下与ER结合（i。Procedres.竞争对手)。与对受体具有较低亲和力的那些化学品相比,对ER具有高亲和力的测试化学品在较低浓度下与放射性标记的配体竞争。该测定由两个主要部分组成:表征受体-配体相互作用参数和记录ER特异性的饱和结合实验,随后是表征测试化学品和放射性标记的配体之间结合ER的竞争的竞争性结合实验。 6.CERI和FW结合测定的验证研究已经证明了它们对于其预期目的的相关性和可靠性(2)。 7.本测试指南中使用的定义和缩写见附件1。 与受体结合测定相关的范围和限制 8.这些测试方法被提出用于筛选和优先排序目的，但也可以提供分子引发事件（MIE）的信息，可用于证据权重方法。它们解决了在体外系统中与ERα配体结合结构域的化学结合。因此，结果不应直接外推到体内完整内分泌系统的复杂信号传导和调节。 9.天然配体17β-雌二醇的结合是一系列分子事件的初始步骤,其激活靶基因的转录并最终以生理变化结束(9)。因此,与ERα配体结合结构域的结合被认为是ER介导的内分泌破坏(ED)的关键机制之一,尽管存在可以通过其发生ED的其他机制,包括(i)与ER位点的相互作用。除了配体结合袋，（ii）与雌激素信号相关的其他受体的相互作用，ER和G蛋白偶联的雌激素受体，内分泌系统内的其他受体和酶系统，（iii）激素合成，（iv）激素的代谢激活和/或失活，（v）激素向目标组织的分布，以及（vi）从体内清除激素。 10.该PBTG解决了物质与人ERα结合的能力,并且不区分ERα激动剂或拮抗剂。该测定不解决进一步的下游事件如基因转录或生理变化。考虑到验证期间仅使用了单一物质，因此尚未解决对测试混合物的适用性。然而,该测试方法在理论上适用于多成分物质和混合物的测试。在对混合物使用测试指南以生成用于预期监管目的的数据之前，应考虑它是否可以为该目的提供足够的结果，以及为什么可以提供足够的结果。当存在对混合物测试的监管要求时,不需要这样的考虑。 11.无细胞受体系统没有内在的代谢能力，并且它们没有与代谢酶系统结合进行验证。然而，在研究设计中可能会纳入代谢活性，但这需要进一步的验证努力。 12.可能使蛋白质（即受体蛋白质）变性的化学物质，例如表面活性剂或可以改变测定缓冲液pH值的化学物质，可能不会进行测试，或者只能在没有 经合组织/ OCDE否则,可以在测试化学品的测定中测试的浓度范围受到其在测定缓冲液中的溶解度的限制。 为了提供信息，表1提供了在本PBTG中描述的两种完全验证的测试方法中测试的24种物质的测试结果。在这些物质中,根据公开的报道,包括ER转录激活的体外测定和/或子宫营养测定(9) (10) (11) (12) (13) (14) (15), 17种被分类为ER结合剂, 6种被分类为非结合剂。参考表1中总结的数据，两种测试方法对所有物质的分类达到10的几乎100％的一致性。-4附件2的hrER结合测定性能标准(3) (表1、2和3)中提供了关于这组物质以及在验证研究期间ER结合测试方法中测试的其他物质的补充信息。 经合组织/ 经合组织/ 邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）作为非粘合剂的使用和分类是基于高达10 - 4 M的测试，因为已观察到该物质在10-3在预验证研究期间，一些实验室中的M（例如浊度）。在验证研究期间，邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）作为编码测试物质在浓度高达10-M.在这些条件下，一些实验室观察到在最高浓度下放射性 †配体结合的减少(10-3M）和/或模糊曲线拟合。对于这些运行，DBP在使用CERI测定的3 / 5实验室和使用FW测定的5 / 6实验室中被分类为“模棱两可”或“结合剂”（参见参考文献（2），第IV. B.3 a，b和VI. A节）。 a分类与预期分类不一致。3 / 5实验室将4 -正庚基苯酚分类为“模棱两可”或“非结合剂”，导致平均分类为模棱两可。仔细检查发现这是由于化学溶解度限制，阻止了完整结合曲线的产生。 b在验证研究期间，苯并（a）蒽被重新分类为非粘合剂（i。Procedres.阴性）基于已发表的文献，证明该物质（16）的体外雌激素活性主要取决于其代谢激活（17）（18）。在该相互验证研究中使用的无细胞hrER结合测定中不会预期物质的酶代谢活化。因此,当在FW和CERI测定的实验条件下使用时,该物质的正确分类是“非结合剂”。 hrer结合测试方法组件 基本测试方法组件 13.该PBTG适用于使用ER受体和受体的适当强配体的方法,所述配体可用作测定的标记物/示踪剂,并且可随着测试化学品浓度的增加而被取代。结合测定包含以下两个主要组分: 1)饱和结合和2)竞争性结合。饱和结合测定用于确认受体制剂的特异性和活性,而竞争性结合实验用于评估测试化学品与hrER结合的能力。 控制物质 14.应描述拟议的并行参考雌激素和对照的基础。适当时,并发对照(溶剂(媒介物)、阳性(ER结合剂;强和弱亲和力)、阴性(非结合剂))用作测试方法在测试条件下有效的指示,并为实验间比较提供基础;它们通常是给定实验(1)的可接受性标准的一部分。参考雌激素和对照的完整浓度曲线（i。Procedres.弱粘合剂和非粘合剂)应在每次运行期间在一个板中使用。所有其他平板应含有: 1)高(大约完全置换放射性标记的配体)和中等(大约IC50)浓度的E2和弱结合剂各一式三份; 2)溶剂控制和非特异性结合,各一式三份。 经合组织/OCDE 标准质量控制程序 15.应按照每个测定所述进行标准质量控制程序，以确保活性受体，正确的化学浓度，耐受范围通过多次复制保持稳定，并保留随时间提供预期ER结合反应的能力。 演示实验室的熟练程度 16.在使用此PBTG下的任何测试方法测试未知化学物质之前，每个实验室应通过进行饱和测定以确认ER制剂的特异性和活性以及与参考雌激素和对照（弱结合剂和非结合剂）的竞争性结合测定来证明其在使用测试方法方面的熟练程度。实验室应建立一个历史数据库，其中包含从不同日期进行的3 - 5个独立实验中产生的参考雌激素和对照的结果。这些实验将成为实验室参考雌激素和历史对照的基础，并将用作对将来运行的测定可接受性的部分评估。 测试系统的响应性也将通过测试表2中列出的熟练物质来确认。熟练物质的列表是ER结合测定的性能标准中提供的参考物质的子集(3)。这些物质是可商购的,代表通常与ER结合活性相关的化学物质的种类,表现出对于ER结合预期的合适的效力范围(i.Procedres.强到弱)和非粘合剂(i.Procedres.否定）。对于每种熟练物质，测试的浓度应涵盖表2中提供的范围。每种物质至少应进行三次实验，结果应与预期的化学活性一致。每个实验应独立进行（i.Procedres.用受体，化学药品和试剂的新鲜稀释液），每个浓度重复三次。熟练程度通过对每种熟练程度物质的正确分类（阳性/阴性）来证明。在学习测试方法时，应由每个技术人员进行能力测试。 经合组织/OCDE 经合组织/ (2).4ER结合活性基于用于ER结合和TA测试方法的ICCVAM背景审查文件(BRD) (9)以及从发表和审查的参考研究(10) (11) (12) (13) (14) (15)获 OCDE得的经验数据和其他信息。5使用美国国家医学图书馆的医学主题词（MeSH）将物质分配到一个或多个化学类别中，这是一种国际公认的标准化分类方案（ 可在http: / / www. nlm. nih. gov / mesh上获得）。 6使用美国国家医学图书馆的有害物质数据库将物质分配到一个或多个产品类别中（可在以下网址获得：http: / / toxnet. nlm. nih. gov / cgi - bin /sis / htmlgen? HSDB）7DPB可用作替代对照非粘合剂，最大浓度为10-4M. 8该物质的溶解度极限为10-4M.邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）作为非粘合剂的使用和分类是基于多达10-4M，因为观察到该物质在10-3在预验 证研究期间，一些实验室中的M（例如浊度）。 测试化学品的溶解度测试和浓度范围查找 17.应进行初步测试，以确定每种测试化学品的溶解度极限，并确定进行测试时要使用的适当浓度范围。首先在溶剂中确定每种测试化学品的溶解度极限,并在测定条件下进一步确认。测定中测试的最终浓度不应超过1mM。测距仪测试包括溶剂对照以及八个对数系列稀释，从最大可接受浓度开始（例如Procedre1mM或更低，基于溶解度的极限），并注意到存在混浊或沉淀。