1 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 的生产是一个复杂且昂贵的过程，需要受过培训的科学家在具有挑战性和危险性的工艺条件下安全有效地操作，以符合良好生产规范（）的要求。约的项目被外包给合同开发和生产组织（）进行开发，因此选择一个在工艺开发方面具有广泛专业知识、并能够在从早期临床研究到商业化阶段提供材料的至关重要。生产的一种常见方法是半胱氨酸共轭法，它需要三个步骤。首先是还原反应，使巯基基团可用于与细胞毒性药物连接分子结合。其次是共轭步骤，将细胞毒性药物连接分子添加进去，最后是熄灭步骤，以防止任何不需要的副反应。这个过程通常会产生一系列，其药物与抗体比例（）可以从变化到高达。这个生产过程使得下游处理特别困难，因为它涉及试图去除未反应的细胞毒性药物和工艺杂质，同时又要保持的关键质量属性（），如高单体纯度和最佳的种类。因此，即使在实验室规模上，开发生产和纯化工艺也非常重要，需要考虑如何控制的关键质量属性（），同时采用适用于环境的高效且可扩展的纯化技术以及分析工具箱。在生产规模上，纯化必须遵循强大且符合监管指南的安全程序。该过程还必须按照特定且常常具有挑战性的时间表运作，例如在成功提交新药临床研究申请（）后，必须及时提供足够的临床级材料，以在首次人体试验中生成安全性和疗效数据。开发这样的连接和纯化工艺的起点是确定哪些工艺条件的优化将有助于从实验室规模放大到生产规模。以下案例研究详细介绍了选择哪些工艺条件和方案作为优化目标，以及评估这些参数所提供的生产和纯化的改进结果。如何优化工艺参数来提高 细胞毒性抗体偶联药物() 的可放大性和生产可行性 作者： 卡门·朱兹博士，龙沙（Lonza）高级生物偶联科学家 2 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 材料与方法的生产在本案例研究中，客户的一位科学家已经进行了多批次的小规模实验，将的生产和纯化工艺转移到了龙沙的工艺开发团队。为了生产，半胱氨酸共轭方案与一种特定的、纯化的单克隆抗体（）稀释在缓冲液中共同使用。该过程涉及在°下使用还原剂还原半胱氨酸二硫键，使得游离巯基可用于共轭反应。在共轭步骤中，添加了一种含有有机溶剂的特定细胞毒性药物连接分子。在共轭反应期间，药物连接分子通过马来酰亚胺反应与游离巯基结合，同时将温度保持在°。随后加入一个熄灭剂，以防止与任何游离细胞毒性药物发生副反应。这种类型的反应预期会产生一系列具有不同药物与抗体比例（）的混合物。生产过程优化就可放大性和可生产性而言，已对的生产步骤进行了评估。还原步骤中的反应缓冲液和温度被认定为可能有益的优化参数。这些参数在实验中进行了评估，范围从毫升扩展至升。反应缓冲液的优化在生产过程中使用缓冲液，以确保整个过程中的稳定，以及在最终配方中达到理想的值。大多数单克隆抗体通常在的范围内最为稳定，这在最终的中也经常适用。对于反应过程，最佳的取决于反应类型。对于马来酰亚胺共轭，最佳范围为。在较低的下，共轭效率降低，在较高的下可能会发生与赖氨酸残基的不良共轭。所选择的缓冲液需要在这些范围内具有较强的缓冲能力。例如，比较典型缓冲液（乙酸盐和磷酸盐）的缓冲能力，基于乙酸盐的组成适用于制备单克隆抗体或，而磷酸盐则可能是良好的反应缓冲液（见图）。 3 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 在这个案例研究中最初使用的反应缓冲液的缓冲能力与还原和共轭过程所需的条件不相符。从工艺的稳健性角度来看，这样的设置很容易在过程中由于难以在狭窄的操作窗口内控制而带来生产挑战。有趣的是，在这项研究中，使用原始工艺的过程还产生了次优且意外的结果，高比例的不均匀种类（和）。因此，我们决定评估不同的缓冲液组成，以确定最佳的反应缓冲液来提高工艺的可生产性，并研究其对分布的影响，特别是对和种类的相对丰度的影响。根据其化学性质选择了一系列缓冲液组成。这些缓冲液包含磷酸盐、组氨酸或三羟甲基氨基甲烷（），并涵盖了一系列值。反应过程在模拟设施的内部生产缩小反应器中进行了小规模实验。这允许对多个和缓冲条件进行并行筛选。通过疏水相互作用色谱（）对产生的种类进行了分析。反应温度的优化在生产过程中，加热或冷却的温度梯度持续时间取决于所使用的设备类型。通常，工艺开发在双夹层玻璃反应器中进行，其中在小规模时温度调整相对较快。在大规模生产中，越来越多地使用一次性（）设备，因为它具有几个优点（例如清洁程序变得不再需要，可能导致成本和时间的降低）。然而，一次性设备中的温度调整可能具有挑战性，因为一次性袋通常设置在夹层框架内，反应体系溶液与温控夹层之间没有直接接触。对于具有多批次数量的大规模商业项目，不锈钢反应器可能比一次性设备更有益。不锈钢具有非常高效的热传导性能，但在生产大量时，温度控制可能会变得较慢（参见图以获取概览）。 4 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 在这项研究中，生成专有的原始反应过程使用的温度梯度条件如图所示。在将单克隆抗体在室温下稀释后，溶液被加热至°进行还原反应。然后，溶液被冷却至°进行共轭和熄灭。在理想的反应中，应使用快速且线性的温度梯度。然而，根据规模、设备和加热持续时间，冷却梯度可能会有很大差异。例如，在升规模的一次性混合袋中，从°冷却到°可能需要长达两小时，而在升规模的玻璃反应器中只需分钟。这种冷却时间会增加还原反应的时间，从而可能影响关键质量属性（），如。此外，实际上，温度的增加或减少可能不会像图中的浅蓝色曲线所示的那样线性。另一个令人关注的问题是，在共轭时加入有机溶剂，根据所使用的溶剂和设备，混合过程中可能会出现放热效应，并且回到设定的温度时冷却速度较慢。这可能会对关键质量属性（），如蛋白质聚集水平，产生影响。为了避免由于温度调整时间的改变在放大时改变工艺性能的风险，我们对一个平台温度工艺的可行性进行了调查。为了筛选出这个工艺的最佳温度，我们在相同的内部缩小反应器中使用一系列温度进行了小规模实验。通过时间序列实验监测反应动力学，以确定可扩展工艺的最佳温度条件。 5 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 纯化过程优化的生产与工艺相关的杂质有关，例如游离的细胞毒性药物、游离的连接分子或溶剂，通常通过横向流过滤（，）去除。通过对纯化的可放大性和可生产性进行评估，发现了几个有益于优化的参数。不仅用于粗制的纯化，还用于浓缩和缓冲液置换。通常需要优化的参数包括进料通量、跨膜压。为了优化参数，进行了两项升规模的研究。在第一个实验中，使用的系统，评估了不同的组合在不同进料通量下的效果。然后，在第二个实验中，目标是优化透析过程中的洗涤体积（）的数量，并尽量减少工艺时间，评估了一系列不同的洗涤体积，以确定所需的数量以去除杂质。为了评估残余杂质水平，使用反相高效液色谱（）测量了游离细胞毒性药物和溶剂。 6 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 结果与讨论反应缓冲液的优化结果（见图）显示，与优化的缓冲液相比，使用初始的反应缓冲液时，未共轭的单克隆抗体（）数量以及不均匀的种类（和）相对较高，这表明在初始缓冲液中发生了不完全共轭或副反应。然而，当使用优化的反应缓冲液时，出现了两个改进。首先，观察到不均匀种类显著减少；其次，通过整体向更高的种类偏移，显示了更稳健的控制，这表明共轭效率提高。随后，优化调整缓冲液组成来适用于大规模生产，例如，可以通过选择正确的缓冲盐比例来调整，从而避免使用碱（）或酸（）溶液进行滴定。反应温度的优化结果（见图）表明，这个工艺可以在°的平台温度下运行，而不会影响任何关键质量属性（），因此使得最初的温度梯度，即从°到°的还原和共轭过程，变得多余。避免温度梯度提高了工艺的稳健性，且大大降低了放大时更改设备参数的相关风险。然而，在较低的°温度下，还原反应的完成时间会稍微延长， 7 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 这是由于反应动力学较慢。当将还原步骤在°与°相比较时，平均明显略低。时间序列实验成功地确定了达到最大所需的还原步骤的理想持续时间，以及所需的还原剂量。此外，研究了溶剂添加时升高温度对所得的的影响，结果表明提高温度对这个工艺的影响可以忽略不计。参数的优化在第一个实验中，通过测试不同的进料通量和组合，优化了参数，然后评估了所得到的过滤通量（见图）。目标是最大限度地增加过滤通量，以减少工艺时间，并最大程度地减少对质量属性（如聚集物）的潜在影响。结果显示，随着进料通量的增加，过滤通量也会增加。也会增加过滤通量，但只能上升到某一点。当增加到该点以上时，过滤通量再次减小，这可以通过膜上形成凝胶层来解释。在第二个实验中，使用了经过优化的进料通量组合后，观察到个（见图）足以达到从中最大程度地去除游离细胞毒性药物和溶剂杂质的目的。与原始纯化过程相比，该研究中对纯化的优化减少了所需的数量，并将过程时间缩短了高达。 8 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 未来展望由于这个的工艺开发已经在从毫升到升的规模范围内完成，并且已经生产出支持毒理学研究所需的材料，优化后的工艺将被转移到龙沙的生产设施中，进行升规模的生产。如果这个在早期临床试验中取得成功，该工艺将被转移到龙沙的商业设施，以进一步放大至升规模，生产出公斤到公斤数量的，这通常是用于三期临床试验和商业化所需的量级。结论未经过优化的生产和纯化工艺参数对成功的放大存在相当大的风险。例如，长时间的处理可能会导致蛋白质聚集或影响分布，从而影响产品的关键质量属性（）。本文表明，通过评估未经过优化的参数，如缓冲液组成、温度和处理条件，可以改进实验室规模的生产和纯化工艺。在这些工艺开发研究之后，获得了一个最佳的分布，并将纯化工艺时间缩短了，同时保持聚集水平较低。总之，已经开发出一个稳健、可复制且可扩展的工艺，可以更好地控制该药物候选的关键质量属性，并已准备好进行生产，以生成临床研究所需的材料。 9 如何优化工艺参数来提高细胞毒性抗体偶联药物的可放大性和生产可行性 参考文献 关于龙沙集团 龙沙是全球制药、生物技术与营养市场的优秀合作伙伴。我们致力于助力客户推出创新药物辅助治疗一系列的疾病，成就更健康的世界。为达成这一使命，我们将先进生产生产、科学专业技术、卓越工艺及技术洞察力完美结合。为满足客户复杂的需求，我们的业务按四大板块划分为生物技术、小分子、细胞与基因、胶囊与健康原料。我们全方位的产品与服务帮助客户在医疗保健行业的发现与创新成果实现商业化。 更多详情，请访问：www.lonza.com.cn,www.lonza.com