生物信息学方法下糖尿病微血管并发症关键基因与通路筛选及中药预测研究

荣旺1，朱占兰2，宋亚一3* 1南京中医药大学附属连云港医院内分泌科，连云港222000；2南京医科大学康达学院附属连云港市立东方医院检验科，连云港222042；3连云港市妇幼保健院中医科，连云港222000 摘要：本研究利用生物信息学方法对糖尿病微血管并发症（microvascularcomplicationsofdiabetesmellitus）基因表达谱芯片进行分析，获取疾病的关键基因及相关信号通路，探索糖尿病微血管并发症的分子机制，预测治疗糖尿病微血管并发症的潜在中药。首先从GEO数据库下载关于糖尿病微血管并发症的基因表达谱芯片数据集GSE43950，利用GEO2R在线分析工具筛选糖尿病微血管并发症差异表达基因（differentiallyexpressedgenes，DEGs）并可视化，对DEGs利用DAVID在线分析数据库进行基因本体论（geneontology，GO）和通路富集（KyotoEncyclopediaofGenesAndGenomes，KEGG）分析，通过STRING在线分析工具、Cytoscape软件及其插件cytoHubba对糖尿病微血管并发症的DEGs进行蛋白互作（protein-proteininteraction，PPI）网络分析，寻找关键基因，随后将关键基因映射到医学本体信息检索平台（coreminemedical），筛选治疗糖尿病微血管并发症的潜在中药，同时构建“药物-活性成分-作用靶点”网络。最后共获得692个DEGs，包括121个上调基因和571个下调基因。GO功能注释显示DEGs参与了血液凝固、止血的调节、中性粒细胞活化免疫应答、DNA的特异性结合等生物过程，KEGG信号通路分析主要涉及MAPK信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、糖尿病微血管并发症中的AGE-RAGE信号通路等。利用蛋白互作数据库STRING以及Cytoscape软件中的cytoHubba分析DEGs，获取了前10位的hub基因，分别是CD4、IL1B、TLR4、TLR2、ITGAM、CD86、CSF1R、TLR8、CYBB、TLR1。通过关键基因筛选得到治疗糖尿病微血管并发症的潜在中药为黄芩、丹参、川牛膝和郁金。包括TLR2、TLR4、IL1B等在内的10个关键基因可能在糖尿病微血管并发症发生发展中起重要作用，黄芩、丹参、川牛膝和郁金等中药可能是糖尿病微血管并发症治疗的潜在分子药物来源。 关键词：生物信息学；糖尿病微血管并发症；差异表达基因；中药靶点预测 中图分类号：R285.6文献标识码：A ScreeningofkeygenesandpathwaysofmicrovascularcomplicationsofdiabetesmellitusandpredictionoftraditionalChinesemedicinebasedonbioinformatics RONGWang1,ZHUZhan-lan2,SONGYa-yi3* 1DepartmentofEndocrinology,LianyungangHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityofChineseMedicine,Lianyungang222000,China;2ClinicalMedicalLaboratory,LianyungangOrientalHospitalAffiliatedtoKangda Medicine,LianyungangMaternityandChildHealthCareHospital,Lianyungang222000,ChinaAbstract:Withanalyzingthegeneexpressionprofileofmicrovascularcomplicationsofdiabetesmellitus(MCDM)bybioinformatics methods,we may obtain its key genes and signaling pathways to explore the molecularmechanismofMCDMandpredictthepotentialtraditionalChinesemedicine.ThegeneexpressionprofileofMCDMwasdownloadedfromtheGSE43950dataset.Wescreenedthedifferentiallyexpressedgenes(DEGs)with GEO2Ronlineanalysis tool.Pathway andfunctional enrichment analyses was performed byusing DAVIDdatabaseonlineanalysis tool,such asgene ontology(GO)andKEGGpathwayenrichment.Protein-proteininteraction(PPI)networkwasvisualized.ThekeygeneswereidentifiedbyusingSTRINGonlineanalysistool,Cytoscapesoftwareanditsplug-incytoHubba.Thenthekeygenesandthemedicalontologyinformationretrievalplatform(coreminemedical)weremappedagainsteachothertosingleouttheChinesemedicineforthetreatmentofMCDMandconstructthenetworkof“drug-activeconstituent-target”.Finally,atotalof692DEGswereobtained,including121up-regulatedgenesand571down-regulatedgenes.TheGOfunctionandKEGGsignalpathwayenrichmentanalysisrevealedthatDEGsinvolvedinthebiologicalprocessessuchasbloodcoagulation,hemostasis,neutrophil activation immune response,core promoter sequence specific DNA binding andparticipatedinsomesignalingpathways,includingMAPKsignalingpathway,AGE-RAGEsignalingpathway,NF-κBsignalingpathwayandtolllikereceptorsignalingpathway,etc.TenhubgeneswereextractedfromtheCytoscapesoftware,whichwere CD4,IL1B,TLR4,TLR2,ITGAM,CD86,CSF1R,TLR8,CYBB,TLR1.Throughscreeningofkeygenes,thepotentialChinesemedicinefortreatingMCDMincludingScutellariaeRadix,SalviaeMiltiorrhizaeRadixetRhizoma,CyathulaeRadix,CurcumaeRadix.ThesekeygenesincludingTLR2,TLR4and IL1B may play an important role in the development of MCDM,Scutellariae Radix,SalviaeMiltiorrhizaeRadixetRhizoma,CyathulaeRadix,CurcumaeRadixmaybecomethepotentialmolecularmedicinesourcesfortreatingMCDM. Keywords:bioinformatics;microvascularcomplicationsofdiabetesmellitus;differentiallyexpressedgenes;predictionoftraditionalChinesemedicine 近年来，糖尿病的相关流行病学调查研究显示，全中国十八周岁以上人群高血糖发生率已经达到11.2%[1]，糖尿病的发生率呈持续上升趋势。糖尿病是一种复杂的血糖代谢紊乱性疾病，到病程一定阶段，可出现多种慢性高血糖的急慢性并发症，以微血管及大血管相关并发症最为常见。慢性高血糖和遗传易感性最终会影响微血管，导致主要来自肾脏、眼睛和神经系统的并发症[2]。经典的糖尿病微血管并发症包括糖尿病肾病（DKD）、糖尿病性视网膜病变（DR）和糖尿病神经病变（DPN）[3]。DKD是仅次于各种肾小球肾炎的终末期肾病（ESRD）的主要病因，DR是影响视力甚至致盲的常见因素，DPN是造成足部溃疡和进一步截肢的重要高危因素。这三种微血管并发症严重影响糖尿病患者的健康，给患者及社会造成严重的经济负担。然而，关于糖尿病微血管并发症具体的发病机制，现代医学还不完全了解，以单纯的西药治疗机制复杂的糖尿病微血管并发症难以获得良好的效果。中医药源远流长，临床疗效经过长久的时间验证，尤其在治疗部分慢性病症方面优势明显。中医讲究整体观念，天人合一，临床施治强调辨证论治，中药相对于单一成分的西药，可以针对人体疾病的复杂多变的情况，通过多环节、多层次、多靶点的整合调节起到治疗作用，但缺少系统的机制阐述。因此需要进一步对糖尿病微血管并发症研究，以期获得疾病发展和进展相关的病理生理机制，挖掘潜在的中药治疗药物。 随着生物信息学的快速发展，有效利用目前丰富的基因表达芯片和高通量测序数据，对临床样本进行大数据挖掘分析，有助于疾病致病机理的探究，为临床提供更多的参考。本研究利用高通量测序，从GEO数据库下载关于糖尿病微血管并发症的基因表达谱芯片的数据进行分析，筛选出长期血糖控制不佳伴有严重微血管并发症与长期血糖控制不佳不伴有微血管并发症之间的DEGs，对DEGs进行功能和通路富集分析以及分析蛋白质间的互作关系， 进一步筛选出参与糖尿病微血管并发症发病机制的关键靶分子及潜在中药，为临床诊治及预防提供新的线索。 1材料与方法 1.1基因芯片数据 GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），是目前基因表达数据最大、最全面的公共资源，广泛应用于科研的各个领域。使用关键词“microvascularcomplicationsofdiabetesmellitus”进行搜索，下载GSE43950数据集。GSE43950数据集位于GPL10379平台（Rosetta/MerckHumanRSTACustomAffymetrix2.0microarray[HuRSTA-2a520709]），表达谱芯片类型为expressionprofilingbyarray，种属为Homosapiens。GSE43950数据集共包含14个样本，筛选出长期血糖控制不佳并伴严重微血管并发症的糖尿病患者5例，4例长期血糖控制不佳不伴有微血管并发症的对照组样本。 1.2DEGs的获取 GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）是GEO数据库的在线分析工具，用来进行DEGs的分析。GEO2R基于R程序语言，利用R语言中两个程序包，即GEOquery和limma，应用t检验来筛选DEGs，并利用R语言对筛选结果进行可视化。本研究以P值（P-value）<0.05，|log2foldchange(log2FC)|≥1.5作为DEGs筛选的标准