层析介质寿命和清洁验证综合设计的良好实践白皮书

层析介质寿命和清洁验证综合设计的良好实践 cytiva.com.cn 目录 引言3 层析介质寿命、清洁和保存验证的综合设计4 层析介质清洁程序的开发4 污染物与清洁工艺试剂5 清洁工艺参数的研究5 清洁工艺的放大7 层析介质缩小模型的寿命和清洁验证7 缩小模型的构建与确认7 层析介质寿命验证的设计8 层析介质缩小模型的清洁验证的设计11 层析介质寿命和清洁验证综合设计案例13 层析介质商业化规模的清洁验证14 商业化规模清洁验证的方法14 分析方法和可接受标准 14 商业化规模清洁验证案例15 层析介质寿命和清洁的持续确认16 持续监控和维持16 变更控制16 层析介质的保存验证 16 散装条件下的层析介质保存验证17 装柱条件下的层析介质保存验证17 生产工艺的预防步骤18 工艺操作的预防步骤18 生产工艺中的污染物控制 18 GMP操作控制18 原材料控制18 缓冲液配制的控制19 对供应商的要求20 合格的供应商具有充实的研究数据20 层析介质CIP稳定性数据 20 污染物控制的数据 21 保存溶液的抑菌和清除数据 22 结论23 缩略语23 参考文献 24 引言 在整个生物药物生产工艺中，层析介质是至关重要的原材料。层析介质对于实现生物制品的纯度、有效性以及安全性都非常重要，需要对其进行足够的控制以实现工艺性能和产品质量的一致性。 对于生物药物工艺，大多数时候层析介质是特定于专用产品使用，但通常会选择多循环次数使用。从工艺经济性角度，如果能够使用层析介质至一定的循环次数，再使用新的层析介质替换，可以很好的降低层析介质的成本。 层析介质的多循环使用使得在生物药物的注册审评以及常规的生产检查中，层析介质成为监管机构关注的重点。FDA早在1997年的“人用单克隆抗体产品的生产和分析考虑要点”中就要求必须要有预先设定的使用限值[1]。EMA也在一项CPMP的声明中指出，大多数宿主细胞蛋白是利用层析柱来去除的，其选择性不仅仅取决于层析介质的质量，而且还涉及层析介质的重复使用、保存条件和清洁与消毒等[2]。《中国药典》三部的“人用重组单克隆抗体制品总论”中也提到需要验证纯化用材料（如色谱柱介质）的重复适用性的可接受性限度[3]。 尽管众多法规对层析介质的寿命、清洁和保存都提出了要求，但近几年的FDA483表格还是有不少针对层析介质验证的审查评论（表1-1）[4]。层析介质验证的问题在各种会议上持续的被讨论，以及在监管机构的许可审评和常规检查中不断的被质疑，这并不令人惊讶，不过究其原因还是验证数据是否充分的问题，这也凸显了层析介质验证设计的重要性。 表1-1：美国FDA关于层析介质寿命和清洁验证的审查意见 层析纯化层析柱的消毒和保存尚未完成验证 缺少纯化层析柱在整个寿命期间的清洁验证数据没有研究数据支持层析柱两次使用之间的保存 层析柱系统的清洁验证不充分，因为缺少对内毒素和微生物限度的评估不能确定清洁程序是否基于验证过的分析方法 没有用于支持层析柱清洁的验证数据 本文将从现有的法规要求和生物药物开发实践出发，提出层析介质寿命和清洁验证的一种综合设计，可以满足产品和工艺需求以及监管机构的期望，并实现优异的工艺经济性。 层析介质寿命、清洁和保存验证的综合设计 层析介质的寿命验证是证明层析介质在其预期使用时间期限内能够维持其可接受的性能特征，并且可持续的生产出符合预期质量标准的产品。层析介质的寿命验证一般在缩小模型上进行。 层析介质的清洁验证则主要是证明清洁程序能够将层析介质的批次使用之间残留物的量最小化。层析介质清洁程序的开发一般在缩小模型上进行，而清洁程序的验证则需要综合使用缩小模型和商业化规模。 层析介质的清洁程序还应包括保存步骤，PDA技术报告60-3号曾明确指出应证明层析介质在预期寿命内的维持其性能特征所需要的保存时间和保存条件[6]。另外，保存溶液的抑菌和抑真菌作用应成为这些研究的一部分。 有效的清洁程序往往是层析介质的稳定性与清洁有效性之间的平衡。因此，层析介质的清洁程序同时还影响了层析介质的寿命，需要对寿命验证、清洁和保存验证进行综合设计。PDA在其14号和60-3号技术报告中都支持层析介质的寿命验证与清洁验证可以并行进行[5,6]。 结合法规要求、生物药物开发的实践要求，建议的层析介质寿命和清洁验证的程序步骤应包括： •层析介质清洁程序的开发 •层析介质缩小模型的寿命和清洁验证 •层析介质商业化规模的清洁确认 •层析介质寿命和清洁的持续确认 •层析介质的保存验证 层析介质清洁程序的开发 层析介质的清洁程序本应是层析纯化工艺固有的一部分。特定的层析纯化必须要包含特定的层析介质清洁程序（表2-1）。 表2-1：常规的层析柱清洁程序 程序步骤目的时间举例注释 再生恢复层析介质原有功能每个层析循 环之后 2CV1MNaCl（IEC）去除功能基团上结合力较强的杂质 检查UV、pH和电导曲线是 再平衡恢复填料至下一循环的每个层析循起始条件环之后 去除再生步骤不能去除 3-4CV平衡缓冲液 按照来料和层析介质的性质和 否回归基线 对层析的再现性很重要 反向冲洗，低流速会有较 CIP 的杂质，防止污染物的每1-10循环累积 稳定性确定方案 好效果 消毒去除微生物每批次之间0.5-1.0MNaOH处理30-60min防止微生物的生长以及去 除内毒素 保存防止微生物和内毒素污非连续生产染操作之间 按照介质储存要求。比如 0.01MNaOH或20%乙醇 保存条件与层析介质寿命息息相关 污染物与清洁工艺试剂 层析介质清洁程序的开发需要考虑两方面的因素，一是层析纯化工艺中所面临的杂质和污染物；二是选择合适的清洁工艺试剂（表2-2）。 杂质清洁试剂 表2-2：层析介质清洁中的杂质和清洁试剂举例 可溶性蛋白NaCl、低离子强度缓冲液、水 沉淀性蛋白NaOH、醋酸、NaCl、水 疏水性蛋白NaOH 脂类非离子型去污剂、乙醇、异丙醇、丙酮 核酸类NaOH、NaCl、DNase 内毒素NaOH 病毒NaOH NaOH是层析介质清洁程序中最常用到的清洁试剂，可以有效的去除多种类型的杂质，并且成本很低。除此之外，NaOH还能够灭活大多数的细菌、真菌、病毒，甚至包括内毒素，可作为有效的消毒试剂使用[7]。对于耐碱性优异的层析介质，比如琼脂糖基架层析介质可耐受1MNaOH清洁和消毒，NaOH是清洁程序的最佳选择。 对于不耐碱的层析介质则可以选择酸性条件清洁，比如pH3的乙酸或者磷酸溶液。其他替代溶液可以选择6M盐酸胍或者8M尿素。6M盐酸胍对不锈钢有腐蚀，是最后的选择。 对于脂类或者脂蛋白等疏水性杂质可考虑使用有机溶剂，比如20%乙醇或者30%异丙醇，其他有效的试剂包括丙酮或者非离子型去污剂。 核酸类杂质，使用1MNaOH与1MNaCl的混合溶液可以有效的去除，DNase也可以用于核酸杂质的去除，但是成本高，并且需要开发分析方法检测其残留和验证其清除，因此不适合用于生物药物的生产工艺。 清洁和消毒试剂的类型和使用浓度与层析介质的兼容性密切相关。需要供应商提供层析介质的化学耐受性信息。 清洁工艺参数的研究 许多清洁工艺参数都会对层析介质清洁的有效性产生影响，这包括污染物与层析介质之间的相互作用的性质和程度、清洁工艺试剂与污染物之间相互作用的性质、清洁时间（脏的维持时间和清洁时间）、清洁试剂的类型和浓度、温度、清洁动作（流动特性，比如停滞、流动和压力）以及液体的特性（pH、电导率、粘度等）。除了清洁动作，其他参数都是独立于层析系统设备的。 需要进行实验研究来考察清洁工艺参数。与层析纯化工艺参数的研究类似，可以首先使用风险管理工具，比如失败模式与效应分析（FMEA），对清洁工艺参数的失败风险程度进行排序，从而选择出失败风险较高的清洁工艺参数进行下一步的实验研究。 清洁工艺参数的实验研究可以在实验室规模上采用缩小模型进行，关于缩小模型的构建和确认，我们将在下述的章节进行详细讲述。实验室规模的清洁工艺参数研究可以使用单因素实验或者实验设计（DoE）的方式进行。实验设计的方法可以探索清洁工艺参数之间的相互作用，比如不同的清洁试剂之间的协同作用即存在相互影响。 50mM NaOH 50mM NaOH +1M 30mM NaOH 15mM NaOH 10mM NaOH PBS 50mM NaOH 50mM NaOH +1M 30mM NaOH 15mM NaOH 10mM NaOH PBS OnecleaningstepX 6M Gua-HCI 6M Gua-HCI NaClNaCl CIPXCIPX 6M Urea 6M Urea Twocleaningsteps:100mM 1-ThioglycerolfollowedbyX Relativeproteinconc.(fouling) Relativeproteinconc.(fouling) 图2-1：抗体纯化工艺中筛选对蛋白A亲和层析介质的一步与两步清洁试剂[8]。两步清洁试剂可避免严苛的清洁条件，有利于维持层析介质的稳定性 PDA技术报告49号对清洁工艺参数提出了“设计空间”的概念[9]。设计空间是指能够提供质量保证的输入变量和工艺参数的多维组合。清洁工艺的设计空间可由每个清洁工艺参数的范围表征研究获得，该设计空间可以保证清洁工艺的效果的可接受性。 对于成本较高的层析介质，比如蛋白A亲和层析介质，则需要开发特定的清洁和消毒程序，以平衡清洁效率与层析介质使用寿命的平衡。Cytiva研究使用高通量工艺开发工具Predictor™96孔板来开发蛋白A亲和介质的清洁程序，同时考察清洁试剂对亲和介质的稳定性影响[10]。 12345678910 1.PBS(control) 2.0.1MNaOH 3.0.2MNaOH 4.0.5MNaOH 5.0.1MNaOH,30%iso 6.0.1%commercialdetergent 7.0.1MNaOH,1MNaCl 8.0.1MNaOHfollowedby0.1Mcitricacid 9.0.1%commercialdetergentfollowedby0.1MNaOH 10.Blank(control) 图2-2：使用高通量工艺开发工具研究层析介质MabselectSuRe™经不同清洁试剂清洁处理后的蛋白杂质残留 MabSelectSuRe™,20oC 10 8 6 96 9492908886 4 2 84 0 0.0 0.51.0 NaOHconcentration(M) n-propanolconcentration(%) 图2-3：使用高通量工艺开发工具研究不同类型和浓度清洁试剂的组合对层析介质MabselectSuRe™的结合载量的影响[11] 清洁工艺的放大 在实验室规模上选择的清洁工艺试剂和清洁工艺参数应能够实施在更大规模的工艺设备上。在进行正式的清洁验证之前，还应在大规模的生产中确认污染物的去除和清洁试剂的清除。 在工艺放大阶段可以基于工厂车间的历史经验和实验室规模的研究基础进行清洁工艺的调整。应在大规模的生产工艺中建立最终的清洁工艺操作和性能参数的操作范围，并且要符合GMP的要求。 层析介质缩小模型的寿命和清洁验证 在缩小模型上进行层析介质的寿命验证可以前瞻性的提供层析介质使用寿命的预估，并为商业化规模的生产提供保证。 在层析介质的寿命验证中以空白运行的方式设计加入清洁验证，则可以在缩小模型的持续运行上验证清洁程序的有效性以及对残留物累积的阻止。 缩小模型的构建与确认 FDA、EMA和PDA关于工艺验证的法规指南都强调了缩小模型的重要性。法规指南对缩小模型的要求是要能够代表商业化规模工艺的性能，包括工艺性能和产品质量[12,13,6]。 为减少规模之间的可变性，应尽可能使用与商业化规模生产工艺一致的原材料，包括使用相同质量标准的层析介质、过滤器、试剂和溶液等。