科学报告|(2022) 12:10007| https://doi.org/10.1038/s41598-022-14554-71 打开铁死亡相关的鉴定肝细胞癌总生存期预测基因罗连香1,2,3, 姚馨月4, 景翔1, 黄芳芳5 & 罗慧1,2,3铁死亡是一种依赖铁的新型细胞死亡，与肿瘤的发展密切相关。肝细胞癌（HCC）是一种高发病率的恶性肿瘤。尽管一些报道证明了铁死亡相关基因与 HCC 之间的关系，但尚未挖掘出更多细节。在本研究中，我们分别从 TCGA-LIHC 项目和 ICGC 门户网站收集和分析了 HCC 患者的数据集。通过生物信息学方法，我们筛选了126个差异表达基因。然后用四个基因（GPX2、MT3、PRDX1和SRXN1）建立预后模型。 PRDX1是预后模型的枢纽基因，在肝细胞癌肿瘤组织和细胞系中高表达。我们进一步发现，沉默 PRDX1 增加了 HEPG2 细胞中亚铁离子的积累和脂质过氧化的积累，并促进了肝细胞癌中的铁死亡。总之，该研究表明四基因特征可用于预测 HCC 预后。它还揭示了铁死亡相关基因 PRDX1 在 HCC 中的潜在功能，它可以作为预测 HCC 结果的生物标志物。肝细胞癌（HCC）是最常见的异质性恶性肿瘤之一，是第六大最常见的肿瘤和第四大癌症死亡原因1.肝癌的发病率和死亡率逐渐上升，HCC约占原发性肝癌的90%1.关于HCC发病机制复杂，一些关于HCC的病因和发展的报道推测其与肝硬化、病毒性肝炎、特定化学致癌物、激素调节异常等有关。2.然而，HCC的早期诊断和治疗仍然是一个问题，特别是在低水平的医学发展中国家3.尽管 HCC 的诊断和治疗技术正在迅速发展4，HCC 的预后很差，大约 70% 的 HCC 在接受切除或消融后 5 年内复发5.目前，由于早期临床症状不明显，大部分患者在中晚期首次确诊，错过了可选治疗期。因此，需要更多的努力来识别HCC的早期诊断生物标志物，它们的利用有利于患者及时有效的治疗。铁死亡是一种不依赖铁的细胞死亡形式，其特征和机制不同于细胞凋亡、坏死和自噬，其特点是脂质活性氧（ROS）的积累6.胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白（系统 Xc−) 和典型谷胱甘肽途径中的谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 是铁死亡机制的两个重要调控点7.系统 Xc−可以调节细胞内谷氨酸和细胞外胱氨酸的交换8.而GPX4作为分布于哺乳动物体内的硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶的独特成员，在抑制细胞铁死亡过程中脂质活性氧的产生中起关键作用9.有趣的是，半胱氨酸阻碍了谷胱甘肽 (GSH) 的生物合成，谷胱甘肽是 GPX4 的底物。因此，系统 Xc 的相互作用−GPX4 诱导 ROS 的积累和铁死亡6.索拉非尼作为晚期HCC标准一线药物，可抑制Xc系统− 并诱导铁死亡发挥其细胞毒作用10.先前的一些研究也报道了铁死亡对肝癌治疗和预后的重要性13, 但在 HCC 的发生和发展过程中, 中枢铁死亡相关的调控因子和铁死亡的潜在调控机制尚未得到证实。详细调查。在这项研究中，我们基于 TCGA（癌症基因组图谱，https://portal.gdc.cancer.gov/repository）数据集系统分析了 HCC 中的一些铁死亡相关基因，并试图阐明它们如何影响1广东医科大学海洋生物医学研究所,广东湛江 524023 2南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江），广东 湛江 524023 3广东湛江海洋生物医学研究所,广东湛江 524023 4广东医科大学第一临床学院,广东湛江 524023 5广东医科大学研究生院,广东湛江 524023邮箱：luolianxiang321@gdmu.edu.cn； luohui@gdmu.edu.cn 科学报告|(2022) 12:10007 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14554-72图1。整体研究设计的流程图。HCC的发病机制和预后。我们希望这些生物标志物对HCC的诊断、治疗和预后有所帮助。结果鉴定差异表达的 FRG。执行流程图以完整描述我们的研究（图1）。训练队列来自 TCGA-LIHC 项目，其中包含 374 个肿瘤样本和 50 个正常样本。同时，我们从 FerrDb 数据库（http://www.zhounan.org/ferrdb）中获得了 214 个铁死亡相关基因（FRG），其中包括 98 个驱动因子、94 个抑制因子和 101 个制造者。交叉两个数据集以获得 200 个铁死亡相关基因的列表，以及它们在 TCGA-LIHC 队列中的表达谱。 “limma” R 包用于分析 FRGs 的表达模式。该分析确定了 126 个差异表达的 FRG，包括 110 个高表达基因和 16 个低表达基因（图 2A）。然后，我们试图描述 126 个差异表达基因 (DEG) 的简单核苷酸变异的总体情况。我们发现上调基因和下调基因之间的变异分类和变异类型具有相同的分布（图2B，C）。要调查所有 DEG 的相关性，请通过 STRING 网站 (https://string-db.org/) 对这些 DEG 进行分析。结果，PPI 网络，由 Cytoscape 软件（版本 3.8.2）可视化，橙色表示高表达，而蓝色表示低表达（图 2D）。预后模型的建立与评估。为了更深入地了解 FRG 在 HCC 中的作用，我们应用了单变量 Cox 回归分析并接收了 19 个预后基因（表 1）。采用LASSO（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）回归分析得到与HCC总生存期明显相关的基因（图3A），需要对所选基因模型进行交叉验证（图3B） ）。为了获得稳定的预后相关基因特征，在 LASSO 方法之后，通过逐步多变量 Cox 回归分析对与总生存期 (OS) 相关的 19 个基因进行处理。之后，我们最终构建了 HCC 总生存期的四基因特征，这四个基因是 GPX2、MT3、PRDX1 和 SRXN1（图 3C）。根据多元 Cox 回归系数，每个样本的风险评分 科学报告|(2022) 12:10007 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14554-73图 2。肝细胞癌患者中上调和下调的差异表达基因。(一个) 显示癌症基因组图谱 (TCGA) 队列的正常组织和肿瘤中 126 个差异表达基因表达的热图。 (公元前) 基因突变信息摘要上调基因（乙) 和下调基因 (C) 在 TCGA 数据集中。 (D) PPI 网络表明了差异表达基因之间的相互作用。基因人力资源95% 置信度磷价值ABCC11.0811.008–1.1590.029AKR1C11.0031.001–1.0050.001AKR1C21.0051.001–1.0090.017AKR1C31.0051.001–1.0080.015EMC21.0751.006–1.1470.032FTH11.0021.000–1.0030.037超光速1.0001.000–1.0000.010G6PD1.0091.003–1.0060.006GPX21.0011.001–1.002< 0.001HMOX11.0131.004–1.0220.005MT31.1101.030–1.1960.006NNMT1.0011.001–1.002< 0.001NQO11.0031.001–1.0050.007PGD1.0071.002–1.0120.005PRDX11.0031.002–1.005< 0.001SLC2A11.0471.006–1.0900.024SQSTM11.0061.003–1.009< 0.001SRXN11.3531.187–1.542< 0.001TXNRD11.0181.010–1.026< 0.001表格1。癌症基因组图谱中 DEG 的单变量 Cox 回归分析。缩写：HR，风险比； CI，置信区间。计算训练队列。为了保证风险评分组的准确划分标准，我们绘制了一条ROC曲线，根据风险评分搜索截止值，我们得到的截止值为1.275（图4A）。根据临界值，将训练数据集中的 167 名 HCC 患者分为两组，高风险组（n = 25）和低风险组（n = 142）。比较两组的生存状态和四个基因的表达，高危组显然与较高的死亡率和较高的基因表达相关（图 3D-F）。通过相同的过程，验证队列中的 HCC 患者按临界值（临界值 = 0.802）分为高风险组（n = 92）和低风险组（n = 43）（图 4D）。并且风险评分和生存状态甚至基因表达的相关性与训练集相似的结果（图3G-I）。 科学报告|(2022) 12:10007 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14554-74图 3。构建预后基因特征和基于特征的风险评分的过程是 TCGA 和国际癌症基因组联盟 (ICGC) 队列中的一个有希望的标志物。 (一个) 训练队列中 19 个与铁死亡相关的潜在预后基因的 LASSO 系数分布。 (乙) 生成的对数 (lambda) 序列的系数分布图，用于选择最佳参数 (lambda)。 (C) 森林图显示与肝细胞癌患者生存相关的铁死亡相关基因。 (D-I) 左边代表训练中患者的生存状态 (D) 和验证 (G) 群组；中心表示训练中风险评分的分布（乙) 和验证(H) 群组；右侧表示训练中高风险和低风险组分类器中预后特征基因的表达模式（F) 和验证 (我) 队列。接下来，我们应用 Kaplan-Meier 分析来分析训练队列中高风险组和低风险组之间的生存状态差异（图 2）。 4B)。 Kaplan-Meier 曲线显示了高风险组和低风险组之间的显着差异（P < 0.0001)。 为了更有说服力，我们绘制了 ROC 曲线来验证 Kaplan-Meier 曲线的结果，更高的 AUC（曲线下面积）意味着更好的性能。 训练集中 1 年、2 年和 3 年对应的 OS 的 AUC 为 0。682, 0.694 和 0。539，分别（图。 4C)。 这两个图也在测试队列中得到验证，我们得到了相同的结果，即 Kaplan-Meier 曲线在两组之间表现出差异表达的 OS（P = 0.025）（图。 4E)，AUC 为 0。534, 0.681 和 0。635 人分别接触了验证集中 1、2 和 3 年的 OS（图 1）。 4F)。 可信的 AUC 可以证明 HCC 患者中 Kaplan-Meier 曲线呈现的预后不良的高危组。 此外，我们还分别用 Kaplan-Meier 方法分析了训练队列和验证数据集中的四个预后基因（图 3）。 S1A-H)。 我们注意到 PRDX1 的表达水平与总生存期明显相关（P = 0.031; P = 0。023)。 然而，四个基因在正常组、肿瘤组和风险组中的表达并没有差异（图 2）。 S1I，J）。然后我们使用 STRING 网站确定了四个基因的关键是 PRDX1 和 SRXN1（图 1）。 S2A-C)。 通过对 GEPIA 网站的探索，我们检查了这两个基因的表达水平，并根据表达水平的 TPM 值绘制了它们的生存曲线（图 1）。 S2D-G)。对于预后模型，应用单变量 Cox 回归分析和多变量 Cox 回归分析来评估临床特征是否是独立的预测预后因素。如图 5 所示，有四个临床参数（年龄、性别、阶段和风险评分），建议风险评分是训练和测试队列中与生存相关的最显着的临床特征（P < 0.05），但ICGC（国际癌症基因组联盟，https://dcc.icgc.org/projects/LIRI-JP）数据集（P = 0.053）中通过多变量 Cox 回归分析处理的风险评分的 p 值比 0.05 多一些。因此，我们认为风险评分可以是一个具有高概率的独立预后预测因子。FRGs 和免疫。为了清楚地评估每个样本中 19 个肿瘤浸润性免疫细胞的比例，CIBERSORT 分析应用于 HCC 样本中 P 值 < 0.05