www.nature.c om/scientificreports人类直系同源物打开循环 miRNA 相关肝细胞癌是小鼠血浆月升高肿瘤检测前丁良浩1、Christina M. Fallgren2、Yongjia Yu3、Maureen McCarthy4、Elijah F. Edmondson5、Robert L. Ullrich6、Michael。 M. Weil2 & Michael D. Story1,7*研究检测循环 miRNA 作为肿瘤前病变标志物的潜力或早期肝细胞癌 (HCC) 因获取样本的困难而受阻来自无症状个体。作为人类样本的替代物，我们确定了基因中的枢纽 miRNA使用携带 HCC 的 C3H 小鼠的共表达网络。我们确认 38 个中心 miRNA 与在源自放射源性 HCC 易感和抗性创始人的 F2 杂种小鼠中与 HCC。什么时候与一组与人类 HCC 相关的 12 种循环 miRNA 相比，有两种没有小鼠ortholog 和其余 10 个 miRNA 中的 7 个与 38 个小鼠 HCC hub miRNA 重叠。使用从 F2 小鼠中连续收集的血浆样本产生的小 RNA 测序数据，我们检查这 7 种循环 miRNA 的时间水平，发现人类的 4循环标志物 miR‑122‑5p、miR‑100‑5p、miR‑34a‑5p 和 miR‑365‑3p 随着接近HCC检测的时间，表明miRNA水平与致癌性相关进展。对 4 种循环 miRNA 动力学变化点的估计表明变化在 HCC 检测前 17.5 至 6.8 个月开始。这些数据确立了这 4 个循环miRNA 作为肿瘤前病变或早期 HCC 的潜在哨兵。血浆或血清中的无细胞循环 miRNA 与各种疾病状况相关，包括癌症1-7。循环 miRNA 对 RNase 降解具有抗性，因为它们要么被包裹在膜囊泡，例如外泌体，或与保护性蛋白复合物结合。可以获得Tey通过微创方法，例如外周静脉穿刺，然后进行标准化离心分离等离子体。这些特征为循环 miRNA 带来了潜在的临床价值，如诊断、预后、和治疗癌症的生物标志物。据报道，几种循环 miRNA 在非常癌症的早期阶段，包括 I 期或 II 期非小细胞肺癌 8-10、乳腺癌 11 和神经胶质瘤 12。这是表明循环 miRNA 可用于在临床前筛查早期或初期癌症进行活检或影像检查的症状或明确证据13。肝癌是全球第四大癌症相关死亡原因。预计到 2025 年，>1每年有 10 万人受到肝癌的影响14。肝细胞癌 (HCC) 帐户约 90% 的肝癌。 HCC 的疾病预后很大程度上取决于诊断时的肿瘤分期，早期 HCC 的 5 年生存率超过 70%，而 HCC 的中位生存期约为 1-1.5 年有症状的晚期病例15,16。改变的 miRNAs 血浆或血清水平已在 HCC 中得到充分研究已经确定了与 HCC 相关的患者和循环 miRNA 组 17。问题仍然存在1德克萨斯大学西南医学中心放射肿瘤科，达拉斯，TX 75390，美国。2科罗拉多州立大学环境与放射健康科学系，柯林斯堡，CO 80523，美国。 3德克萨斯大学医学分院放射肿瘤学系，加尔维斯顿，德克萨斯州 77555，美国。 4 NASA 约翰逊航天中心，休斯顿，TX 77058，美国。 5弗雷德里克国家癌症实验室研究，弗雷德里克，医学博士 21702，美国。 6辐射效应研究基金会，日本广岛市。 7哈罗德C. Simmons 综合癌症中心，德克萨斯大学西南医学中心，达拉斯，德克萨斯州 75390，美国。电子邮件：michael.story@utsouthwestern.edu*科学报告|(2022) 12:10927|https://doi.org/10.1038/s41598-022-15061-51 www.nature.c om/scientificreports/关于 HCC 相关 miRNA 的变化是否可在早期或癌前阶段检测到癌症以及它们是否可以成为早期筛查的候选标志物。很难从早期无症状患者中获取人体样本，因此很难获得动物模型。其他动物，例如小鼠，被广泛用于研究早期生物标志物。然而，使用鼠标模型的挑战是将调查结果转化为人类疾病。我们假设作为关键的功能重要的 miRNA信号通路中的调节因子在不同物种中是保守的，因此研究这些关键 miRNA小鼠将阐明人类生物标志物研究。加权共表达网络分析 (WGCNA) 构建基因网络，也称为模块，包含具有相似表达谱的基因集合。分析背后的理论是基因具有密切功能联系或参与相同途径的以同步模式共表达 18,19。在一个模块内，具有最大连接性的基因被确定为中心基因，表明其重要作用模块内。 WGCNA 还分析了模块和样本特征之间的关联，它提供了探索某些特征背后机制的有效方法。 Te分析已广泛应用于高通量基因组学数据，以识别动物模型以及人类疾病中的关键调节因子和途径20-24。在这项研究中，我们使用来自基因表达和循环的综合数据集进行 WGCNA 分析。辐射诱导的小鼠 HCC 模型中的 miRNA 谱。经鉴定与 HCC 相关的中枢 miRNA与人类 miRNA 标记进行比较，然后在来自基因组的辐照小鼠模型中进行验证。叫异质股票。 Te HCC 相关循环 miRNA 在时间序列研究中被量化，以研究多早可以量化过多的 miRNA。结果基因共表达网络的构建和HCC相关模块的识别在老鼠身上。我们之前发表了 C3H 小鼠中 HCC 的基因表达分析。使用血浆样本从同一队列中，我们进行了小 RNA 测序。基因表达和循环 miRNA 谱被过滤以去除具有小差异的基因/miRNA。总共有 28,630 个基因探针和 1809 个循环将来自每只小鼠的 miRNA 组合起来构建加权基因共表达网络 (WGCNA)。我们遵循 WGCNA 包中的指南，使用 sof -thresholding power 来计算 adja-系数矩阵。通过分析网络拓扑结构，我们选择了一个soft-thresholding power为β=6，这保证了具有良好连通性的无标度网络（R2 = 0.93）（图 1A，B）。大量的共表达模块(758) 由合并的 mRNA 和循环 miRNA 配置文件构建（图 1C）。然而，只有 16共表达模块包含循环 miRNA，并且在 HCC 小鼠中发生显着变化。与非HCC小鼠相比（图1D）。鉴定 HCC 相关共表达中功能显着的中枢循环 miRNA锡安模块。Hub miRNAs 通过评估 16 个 HCC 相关模块中的每个 miRNA 的模块内成员资格和生物学功能。候选 miRNA 表现良好与模块特征值（FDR<0.2）的相关性被认为具有很强的成员资格。特米尔-每个模块中的 NA 也在 mirRDB 功能 miRNA 数据库中查询，然后在 Tar-getScan miRNA 目标数据库。我们在 12 个模块中鉴定了 71 个循环 miRNA，证明了强大的模块内成员资格并与它们在相同模块中的预测基因靶标共存（图2）。在具有异质遗传背景的辐照小鼠中确认与 HCC 相关的循环 miRNA理由。来自 C3H x BALB/c 的第二代弹簧（F2 小鼠）的独立组群杂种被照射并监测HCC。在 1、6、12 和 18 个月时从这些小鼠中收集血浆照射后无需安乐死。在 71 个过度代表的循环中枢 miRNAs 中被识别在荷瘤 C3H 小鼠中，这 71 种 miRNA 中的 38 种的血浆水平也发生了改变（FDR<0.05）。放疗后 18 个月时携带 HCC 的 F2 小鼠（图 3A）。通过检查进行通路分析这 38 个 miRNA 的基因靶标。下调凋亡信号、细胞周期 G1/S 检查点、Pten 信号阿灵； p38 Mapk 信号、p53 信号、mTor、Vegf、Stat3 和 Erk/Mapk 信号的上调包括HCC 小鼠中 38 种 miRNA 标志物影响的显着改变的通路（图 3B）。小鼠和人类 HCC 相关循环 miRNA 的比较。我们假设功能上重要的枢纽 miRNA 在不同物种中是保守的，它们更有可能是小鼠和人类之间 HCC 的 mon 生物标志物。选择了人类 HCC 循环 miRNA 标志物来自先前发表的一项研究，其中发现 12 个循环 miRNA 在 3 个独立的HCC 患者的未决队列 17。在这 12 种 miRNA 中，两种 miRNA 是物种特异性的，在小鼠中不存在。其余 10 个 miRNA 中有 7 个与小鼠中的中枢 miRNA 重叠。七种常见的 miRNA 是在携带辐射诱导的 HCC 的 C3H 小鼠（图 4A）和携带 F2 HCC 的小鼠中显着增加（p < 0.05）辐射后 18 个月的小鼠（图 4B）。在 C3H 小鼠中，辐射诱导的 HCC 中的 7 种 miRNA 也与自发性 HCC 相比，显示出显着增加 (p<0.05)。在 F2 小鼠中，7 种 miRNA 中的 4 种，miR-122-5p、miR-100-5p、miR-34a-5p 和 miR-365-3p，早在放疗后 12 个月就显着增加化（p<0.05）。 MiR-34a-5p 在 6 个月时显着增加 (p<0.05)。在 3 种人类 HCC 标志物中与小鼠中枢 miRNA 不重叠，miR-148a-3p 和 miR-224-5p 在两只小鼠中显着增加同伙； miR-125b-5p 仅在 C3H 队列中增加。使用变化点分析早期检测与 HCC 相关的循环 miRNA 标志物姐姐。在 F2 队列中，在最后一次采集血浆后 3 至 400 天通过尸检检测到 HCC。所有七种人/小鼠 HCC 相关 miRNA 的血浆水平与科学报告|(2022) 12:10927 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-15061-52 www.nature.com/scientificreports/图1。C3H中共表达网络的构建和HCC相关模块的识别老鼠。 (一个) 软阈值与无标度拓扑指数的关系。我们选择 6 作为软阈值能力，达到 R2 = 0.93。 (乙) 作为连通性函数的软阈值功率。 (C) 聚类树状图基因/miRNA 和共表达模块的指定颜色。共表达模块总数：758;含 miRNA 的模块：318 个。D) 含有与 HCC 显着相关的模块的 miRNA。每个模块中显示的数字：顶部，与 HCC 的相关系数；底部，p 值。颜色代表模块和HCC表型之间的相关系数。血浆采集和 HCC 检测之间的天数。最高相关性来自 4 个 miRNA早期升高，即在放射后 12 个月（图 5）。血浆 miRNA 水平的相关性作为科学报告|(2022) 12:10927 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-15061-53 www.nature.com/scientificreports/图 2。在 C3H 小鼠的每个共表达模块中识别出 Hub miRNA（红点）。循环根据 WGCNA 标准，识别出的 miRNA 在每个模块和与 HCC 表型显着相关。蓝线：p < 0.05。HCC 检测前的时间函数表明 7 种循环 miRNA 标志物与肝癌进展。为了估计在HCC诊断之前多久可以检测到增加的循环标志物，我们将 F2 HCC 小鼠中循环 miRNA 的时间序列数据拟合为分段线性回归模型(strucchange::breakpoints)26 检测回归数据结构中的变化点。已识别的模型在人类 HCC miRNA 的 7 个直系同源物中，4 个循环 miRNA 的显着变化点 (p < 0.05)。在 HCC 检测前 13.3 个月和 5.5 个月确定了 miR-122-5p 的两个变化点。miR-100-5p 在 10.4 个月、miR-34a-5p 在 17.5 个月和 6.8 个月检测到变化点对于 miR-365-3p。还计算了每个变化点的 95% 置信范围（图 5）。模型做到了对于其他 5 个