科学报告|(2022) 12:7826| https://doi.org/10.1038/s41598-022-11644-41 打开LncRNA CCAT1 增强靶向QKI-5在肝细胞癌中的化学抗性夏崇生1,2, 孙玉睿1,2, 杨丽1, 马俊丽1 & 静石1癌症治疗失败的一个主要原因是获得耐药性。肝细胞癌 (HCC) 化疗耐药的具体机制需要充分阐明。 lncRNA在一些癌症中涉及耐药性，然而，lncRNA结肠癌相关转录物1（CCAT1）在HCC中奥沙利铂耐药中的确切功能仍不清楚。我们的研究表明，CCAT1 促进 HCC 增殖并减少奥沙利铂诱导的细胞凋亡。敲除 CCAT1 可以增加体外和体内的化学敏感性。进一步研究发现，QKI-5是一种重要的介质，阻断QKI-5/p38 MAPK信号通路可以增强奥沙利铂的敏感性。总之，CCAT1 通过 QKI-5/p38 MAPK 信号通路促进 HCC 的增殖和奥沙利铂耐药。靶向 CCAT1 联合化疗可能是逆转 HCC 治疗中耐药性的有希望的替代方案。作为全球第四大致命癌症，肝细胞癌（HCC）仍然是一个全球性的重大健康问题1.高死亡率是由于晚期诊断有转移或肝储备不足。 HCC 患者，尤其是晚期患者的预后仍然很差。主要包括靶向治疗和全身化疗的治疗选择有限。以索拉非尼为代表的靶向药物，临床获批治疗晚期或转移性肝癌，可延长生存期数月2.由于药物成本和靶向药物的可获得性，化疗药物，尤其是奥沙利铂，仍被认为对选定的晚期 HCC 患者群体有效4.然而，治疗失败的一个主要原因是 HCC 内在或获得性耐药性。常见机制包括药物外排泵、增强DNA损伤修复能力、灭活细胞凋亡等5.然而，奥沙利帕汀耐药的具体机制仍需充分阐明。通过影响转录或转录后水平的基因表达，发现非编码 RNA (ncR-NA)，尤其是长链非编码 RNA (lncRNA) 参与了许多生物学过程，包括增殖、凋亡、自噬和转移7.除了作为许多癌症诊断的生物标志物外，lncRNA 还涉及多种癌症的耐药性9.据报道，lncRNA 的失调与耐药性和放射抗性有关。 LncRNA HULC在HCC中异常表达，并通过USP22/Sirt1/自噬通路与奥沙利铂、5-FU和吡柔比星敏感性显着相关10.发现 LncARSR 通过调节 PTEN-PI3K/Akt 通路促进多柔比星耐药11. lncRNA HANR 通过与 GSKIP 结合促进 HCC 的发展和增强对阿霉素的化学敏感性12.结肠癌相关转录物 1 (CCAT1) 位于 8q24.21，是结直肠癌中常见的扩增基因组区域。异常表达的 CCAT1 与多种癌症的侵袭性恶性肿瘤相关，包括结直肠癌、乳腺癌、鳞状细胞癌和 HCC13.更重要的是，CCAT1 也被认为是某些癌症耐药性的生物标志物。发现CCAT1参与顺铂、5-氟尿嘧啶和紫杉醇耐药17.然而，关于 CCAT1 在 HCC 奥沙利铂耐药中的确切功能知之甚少。在这项研究中，我们确定了 CCAT1 增强奥沙利铂耐药性的可能性并研究了潜在的机制。我们发现CCAT1通过quaking (QKI)-5/p38 MAPK信号通路有效降低奥沙利铂在HCC中的化学敏感性，为HCC治疗提供了新途径。1济宁医科大学附属医院,山东 济宁 272029 2这些作者的贡献相同：夏崇生和孙玉瑞。邮箱：shijing1216@126.com 科学报告|(2022) 12:7826 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-11644-42方法细胞系和转染。HCC 细胞系 HCCLM3 和 HepG2 购自 Procell 生命科技有限公司（中国武汉），在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY) 中培养37 °C 的 5% CO2 培养箱。根据制造商的方案，通过 Lipofectamine™ 3000（Invitrogen，Carlsbad，CA）试剂将 pcDNA-CCAT1 质粒或空载体转染到 HCCLM3 和 HepG2 细胞中。通过CRISPR-CAS9敲除上述细胞中的CCAT1。特异性靶向CCAT1序列的CRISPR指导RNA（forward gRNA GCC CCTGGCCAACTATATCT；reverse gRNA ATTTGGTCATAATGCGGAAA）由Genechem（中国上海）构建并转染到上述细胞中。qRT-PCR。使用逆转录系统试剂盒（TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Japan）提取总 RNA 并逆转录为 cDNA。通过 qRT-PCR 测定 (TaKaRa) 定量 RNA 表达水平，并通过 2-ΔΔCt方法。将这些值标准化为内源性对照 GAPDH。化学敏感性检测。将 HCC 细胞接种在 96 孔板中，并暴露于最终浓度为 0、0.1、1、10、100、1000 μM 的奥沙利铂化疗剂 48 小时。根据制造商的说明，通过细胞计数试剂盒 8（CCK-8，Dojindo，Kumamoto，Japan）测定活细胞。绘制奥沙利铂的细胞存活率和剂量依赖性曲线，用GraphPad Prism 5.0计算和分析50%生长抑制（IC50）值。细胞凋亡测定。该测定通过使用膜联蛋白 V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒 (BD Biosciences, San Jose, CA) 根据方案进行。简而言之，制备处理过的细胞并与 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 在室温下避光孵育 15 分钟。细胞凋亡在一小时内在Canto II流式细胞仪（BD Biosciences）上进行。菌落形成测定。将处理后的 HCC 细胞接种到 60 mm 培养皿中，密度为 500 个细胞/培养皿，并孵育两周。然后将菌落用冰冷的甲醇固定并用 0.1% 结晶紫染色。计算包含超过 50 个细胞的菌落数。免疫荧光 (IF) 染色。处理过的细胞用 4% 多聚甲醛固定，用 0.1% Triton X-100 渗透，用 2% 牛血清白蛋白封闭，并与针对活性 Caspase3 或 QKI-5 的一抗在 4 °C 下孵育过夜。添加相应的 Alexa Fluor-conjugated 二抗 (Life technology, Waltham, MA)，并用 DAPI 对细胞核进行复染。检测 caspase-3 和 caspase-7 活性。将奥沙利铂处理的细胞接种在 96 孔不透明白色板中。 Caspase 3/7 活性由 Caspase-Glo® 3/7 检测试剂盒 (Promega, Madison, WI) 根据制造商的说明进行测定。将空白对照、阴性对照和处理组分别加入100ul反应体系中，培养2h，在Promega Glomax上检测荧光值。蛋白质印迹。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离蛋白质并转移到 PVDF 膜 (Millipore, Bedford, MA)。在用 Tris 缓冲盐水 (TBS)-Tween 20 中的 5% 脱脂牛奶封闭后，在与表 S1 中列出的一抗杂交之前切割印迹，然后用 HRP 缀合的二抗（Proteintech，武汉，中国）。通过在凝胶成像分析系统（Tanon，上海，中国）上使用增强型化学发光试剂盒（Millipore）对免疫印迹进行可视化。细胞分级测定。收获 HCCLM3 和 HepG2 细胞并与裂解溶液一起孵育。离心后，上清液用于评估细胞质RNA，沉淀用于核RNA提取。 GAPDH 和 U6 分别用作胞质和核标志物。体内异种移植研究。使用了 20 只体重 18-20 克、年龄 4-6 周的 BALB/c 雄性小鼠（均来自中国山东大学实验动物中心）。所有实验方案均经济宁医科大学动物使用委员会批准。所有实验均按照相关指南和法规进行。小鼠注射 HCCLM3 和敲除 CCAT1 的 HepG2 细胞，并接受腹腔注射奥沙利铂 (0.8 mg/kg/w)。监测肿瘤生长曲线并使用以下公式计算最终肿瘤大小：V（mm3) = (长 × 宽2) × 0.5（L：肿瘤长度，W：宽度）。免疫组织化学 (IHC) 和 aTdT 介导的 dUTP 缺口末端标记 (Tunel) 测定。通过 IHC 分析在皮下肿瘤组织中检测到凋亡相关蛋白（Bcl-2 和 Active Caspase-3）。在脱蜡、再水化和抗原修复后，将切片与一抗在 4°C 下孵育过夜，然后使用相应的二抗。根据制造商的说明应用 Tunel 法检测皮下异种移植肿瘤中 HCC 细胞的凋亡。 科学报告|(2022) 12:7826 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-11644-43RNA下拉测定。简而言之，将细胞裂解并与生物素（Bio）标记的寡核苷酸探针一起孵育。将珠子在 SDS 样品缓冲液中洗涤和煮沸，并通过标准蛋白质印迹分析验证回收的蛋白质。统计分析。所有统计分析均使用 GraphPad Prism 软件（La Jolla，CA，USA）进行。学生 t 检验用于分析两组之间的差异，当比较两组以上时应用双向方差分析。 p 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。结果CCAT1 调节 HCC 细胞对奥沙利铂的敏感性。我们观察到奥沙利铂处理的 HCCLM3 和 HepG2 细胞中的 CCAT1 表达显着高于其亲本细胞（p < 0.01，图 1A）。为了探索 CCAT1 和奥沙利铂敏感性之间的关联，我们通过 CRISPR-Cas9 敲除 HCCLM3 和 HepG2 中的 CCAT1 表达。随后，将这些具有不同 CCAT1 表达水平的 HCC 细胞系暴露于浓度从 0.1 到 1 mM 增加的奥沙利铂 48 小时，以确定细胞活力和奥沙利铂的 IC50 值。结果表明，与阴性对照组相比，敲除HCCLM3中CCAT1对奥沙利铂的敏感性更高，IC50值更低（IC50：46.56 与 23.22 μM，p < 0.01，图 1B)。如图 1C 所示，HepG2 细胞表现出相同的趋势（IC50：27.98 对 13.28 μM，p < 0.01）。结果表明，CCAT1与HCC中奥沙利铂敏感性之间可能存在相关性。然后我们探讨了受CCAT1影响的HCCLM3和HepG2细胞的增殖和凋亡。菌落形成测定表明，与对照组相比，CCAT1 敲除可以减少这两个细胞中的菌落数量（分别为 p < 0.01。图 1D）。流式细胞术显示敲除 CCAT1 显着增加了 HCC 细胞的凋亡，尤其是在奥沙利铂处理的 HepG2 中（p < 0.001，图 1E）。此外，在 HCCLM3 和 HepG2 细胞中的 caspase-3 活化在各自 IC50 浓度的奥沙利铂存在下进行了测试。如图 1F 所示，敲除 CCAT1 的细胞表现出更高的 caspase-3 活化水平（p < 0.01）。 Caspase-Glo® 3/7 测定表明，与 HCCLM3 和 HepG2 细胞中的对照组相比，敲除 CCAT1 时 caspase-3 和 caspase-7 活性显着增加（p < 0.05，图 1G）。CCAT1 参与体内 HCC 对奥沙利铂的耐药性。为了进一步探索CCAT1对体内HCC化疗的影响，使用稳定敲除的CCAT1（KO-CCAT1）HCCLM3和HepG2细胞构建植入模型。结果表明，在HCCLM3和HepG2中，CCAT1敲除组的肿瘤生长速度明显低于对照组。皮下植入 5 周后，KO-CCAT1 组的平均肿瘤体积明显小于对照组（0.38 ± 0.05 cm3与 0.96 ± 0.17 厘米3; 0.20 ± 0.05 厘米3 与 0.40 ± 0.06 厘米3, p < 0.05, 图 2A,B)。 TUNEL染色检测皮下肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡。如图2C所示，当CCAT1被敲除时，凋亡细胞显着增加。对照组和 KO-C