从疑似结核病患者的呼吸道样本中检测拟病毒

科学报告|(2022) 12:8676| https://doi.org/10.1038/s41598-022-12757-61 打开拟病毒检测来自呼吸道样本在疑似结核病患者中Fatemeh Sakhaee1, Jalal Mosayebi Amroabadi2, Sara Razi3, Farzam Vaziri1,4, Farid Abdolrahimi1, Sina Moghaddam1, Fatemeh Rahimi Jamnani1,4, Seyed Davar Siadat1,4 & Abolfazl Fateh1,4Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APMV) 是一种感染阿米巴的巨型病毒，最近已成为人类呼吸道病原体。本研究旨在评估从疑似结核病 (TB) 的患者收集的呼吸道样本中是否存在 Mimivirus。该研究于 2013 年 4 月至 2017 年 12 月对 10,166 份临床呼吸道样本进行了研究。使用自杀巢式聚合酶链反应 (PCR) 和实时 PCR 方法检测了拟病毒。在 10,166 名疑似结核病患者中，4 名 (0.04%) 的 Mimivirus 呈阳性，包括 Mimivirus-53、咪咪病毒 186、咪咪病毒 1291 和咪咪病毒 1922。在重症监护病房 (ICU) 住院的四分之三的患者接受了机械通气。所有患者都有潜在疾病，在痰液和支气管肺泡灌洗液样本中均检测到病毒。总之，在一项综合研究中，Mimivirus 是从疑似结核病患者中分离出来的。目前的结果与之前的报告相似，表明拟似病毒可能与肺炎有关。需要在世界不同地区进行进一步研究，以进一步研究拟病毒感染的临床重要性。病毒学领域在 2003 年随着阿米巴巨型病毒的意外发现而发生了翻天覆地的变化。这些病毒以前是根据它们的亚微观尺寸来描述的，这可以通过光学显微镜来确定。一些报道表明，阿米巴巨型病毒具有结构、遗传和蛋白质组学的复杂性，与细菌和一些小型真核生物的复杂性相当，并且在病毒中不存在。迄今为止，作为变形虫的巨型病毒，在人类中越来越多地发现了拟似病毒、莫利病毒、浮法病毒、马赛病毒和皮托病毒。1.棘阿米巴多食拟拟病毒 (APMV) 于 2005 年作为拟拟病毒科的主要成员引入。从那时起，通过从土壤、水和人体样本中培养阿米巴，已检测到大约 100 种新的 Mimivirus 菌株2.这些病毒是变形虫体内的病原体，通过从冷却塔收集的水样中培养变形虫来分离3.它们也可能是肺炎的病原体，类似于其他阿米巴相关微生物 (AAM)。总体而言，在社区获得性肺炎和医院获得性肺炎中，病原体的识别都非常重要，因为这些感染是全球发病率和死亡率的主要原因5.在以前的研究中，为了确定 Mimivirus 是否是肺炎的病原体，它通过鼻内途径在小鼠中接种，并且在大多数动物中发现了急性肺炎的组织病理学证据。这些研究的结果表明，这种病毒在实验条件下可以引起肺炎6.然而，关于拟态病毒在全球范围内的流行情况的信息很少，无法确定由这些病毒引起的疾病的机制。此外，在伊朗尚未检测到 Mimivirus 的频率患者。考虑到 Mimivirus 作为致病性呼吸道疾病的病原体的可能作用，本研究旨在检测疑似结核病 (TB) 患者的 Mimivirus DNA，该研究由伊朗巴斯德研究所分枝杆菌和肺部研究部提供。1伊朗巴斯德研究所分枝杆菌学和肺部研究系，伊朗德黑兰。 2人工情报和多组学中心 (AIMOC)，挪威斯塔万格。 3Vira 现代科学先驱 (VIPOMC)，德黑兰，伊朗。 4伊朗巴斯德研究所微生物学研究中心 (MRC)，伊朗德黑兰。电子邮件：afateh2@gmail.com 科学报告|(2022) 12:8676 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12757-62图1。研究人群选择流程图。结核病，结核病； MTC，结核分枝杆菌复杂的; NTM，非结核分枝杆菌。材料和方法研究人群。从 2013 年 4 月到 2017 年 12 月，共有 10,166 名疑似结核病患者入选伊朗巴斯德研究所。目前的研究是根据 1975 年赫尔辛基宣言和当地法规进行的。它也得到了伊朗巴斯德研究所伦理委员会的批准。从所有参与者和父母/法定监护人处获得书面知情同意书。通过巢式聚合酶链式反应 (PCR) 和实时 PCR 分析检测 Mimivirus。使用高纯病毒核酸试剂盒和高纯病毒 RNA 试剂盒（Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Germany）从 10,166 个呼吸道样本（包括痰液和支气管肺泡灌洗液 (BAL) 样本）中提取病毒 DNA 和 RNA。制造商的说明，分别。此外，使用 Proba-NK DNA 提取试剂盒（DNA-Technology Company，莫斯科，俄罗斯）和 QIAamp 分离细菌和真菌基因组®DNA Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, USA)，分别遵循制造商的说明。此外，如前所述，使用自杀巢式 PCR 测定法鉴定呼吸道样本中的拟病毒 DNA5.根据 Dare 等人和 Saadi 等人的研究，如前所述，对于实时 PCR 分析，Mimivirus 基因组的两个不同保守区域被靶向。7.因为我们无法使用 Mimi-virus 作为阳性对照，所以我们制备了一个质粒，其中包含扩增子作为阳性对照。此外，蒸馏水用作阴性对照。为了确认 PCR 检测的结果，AccuPrep®PCR 纯化试剂盒（Bioneer，韩国）用于纯化巢式 PCR 和实时 PCR 产物。接下来，使用 ABI 自动测序仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）对 PCR 产物进行测序。 MEGA 6.0 版用于评估原始测序数据。基于核心基因的Mimivirus系统发育分析。为了评估我们分离的病毒和其他拟病毒家族之间的进化关系，使用核质大 DNA 病毒 (NCLDV) 核心基因进行系统发育分析，包括主要衣壳蛋白、D5 解旋酶、B-DNA 家族聚合酶和 VV A18解旋酶9.PCR 方法用于对这些基因组进行测序，使用几个重叠的扩增子。使用特异性引物通过 PCR 扩增分别覆盖 VV A18 解旋酶、B-DNA 家族聚合酶、D5 解旋酶和主要衣壳蛋白的近全长基因的两个、五个、三个和两个片段来自 Megavirus LBA111 (JX885207.1) 分离物（补充表 1-8）。用高纯度 PCR 产物纯化试剂盒（Roche Diagnostics Deutschland GmbH，Mannheim，Germany）纯化后，使用 ABI 自动测序仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）对纯化的 PCR 片段进行测序。 MEGA 6.0 版用于评估原始测序数据。结果在 10,166 名疑似结核病患者中，有 4 名（0.04%）感染了 Mimivirus（图 1）。在这项研究中，使用 Saadi 及其同事提出的方法获得了最佳结果。此外，所有阳性样本的自杀巢式PCR结果均为阳性，阴性对照为阴性。第一轮和第二轮 PCR 产物分别为 297 bp 和 170 bp，通过 1.5% 琼脂糖凝胶电泳显示（补充图 1）。在对补充图 2A、B 中所示的 PCR 产物进行测序后，绘制了系统发育树。基于核心基因的树表明所有分离的拟似病毒与 科学报告|(2022) 12:8676 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12757-63图 2。基于 B 族 DNA 聚合酶的核苷酸序列构建的邻接树（一个), D5-ATPase-解旋酶 (乙)，主要衣壳蛋白 (C) 和 VV A18 解旋酶 (D) 基因。外群是 Cafeteria roenbergensis 病毒。我们分离的 Mimiviruses 存在于 Mimivirus C 谱系中。谱系 C 的拟似病毒，并显示这些分离株属于拟拟病毒科进化枝 C（Mimivirus chilensis、Megavirus LBA111 和 Courdo11）（图 2）。检查所有阳性样本以确定呼吸道最常见的病毒、真菌和细菌感染原，即结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、嗜血杆菌流感病毒，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，奇异变形杆菌，大肠杆菌，粘质沙雷氏菌，卡他莫拉菌，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，科氏柠檬酸杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，脆弱拟杆菌，中间普氏菌，白色念珠菌，沙氏曲霉，巨细胞病毒、1 型单纯疱疹病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、鼻病毒、副流感病毒和腺病毒。在三个阳性样本中，所有细菌、真菌和病毒因子的培养和 PCR 方法均为阴性（仅对病毒因子进行了 PCR 测试），除了一个与嗜肺军团菌合并感染的样本（图 1）。感染Mimivirus-53的患者是一名患有肾病的25岁女性，她的体征包括发烧、体重减轻10公斤、咳嗽、盗汗、胸痛和呼吸急促。患者已在重症监护病房 (ICU) 接受机械通气超过 8 天。她的临床参数显示白细胞 (WBC) 计数、红细胞沉降率 (ESR) 和 C 反应蛋白 (CRP) 水平升高。维生素 D3 水平低于正常水平（表 1）。计算机断层扫描 (CTS) 显示左下叶实变和双侧基底浸润。该患者的所有肺炎药物均为阴性。在三个痰液样本中，两个样本对 Mimivirus 呈阳性，样本中的循环阈值（Ct）值为 22（补充图 3）。患者开始用阿奇霉素治疗，但20天后症状没有改善，恢复缓慢。感染 Mimivirus-186 的患者是一名 64 岁的糖尿病男性，表现为发烧、呼吸困难、咳嗽和体重减轻。 5年前，他被诊断出患有肺结核。医生推测结核分枝杆菌 (M.tb) 感染复发，但 M.tb 的涂片、培养和 PCR 检测结果均为阴性。此外，该患者的所有肺炎药物均为阴性。他患有急性呼吸衰竭，伴有 WBC 计数、CRP 和 ESR 升高（表 1）。 CTS 提示外周胸膜下混浊。在对三个 BAL 样本进行评估后，发现所有样本均呈 Mimivirus 阳性。此外，BAL 样本的 Ct 值范围为 18 至 20（补充图 3）。感染 Mimivirus-1291 的患者是一名 40 岁男性，感染人类免疫缺陷病毒 (HIV)，CD4 细胞计数低于 300 个细胞/μL，感染乙型肝炎病毒。六个月前，他因卡氏肺孢子菌肺炎和口腔念珠菌病入院治疗。治疗期间，他在 ICU 接受了 12 天的机械通气。治疗 6 个月后，患者主诉咳嗽、发烧和盗汗， 科学报告|(2022) 12:8676 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12757-64变量拟病毒53拟病毒186拟病毒1291拟病毒-1922年龄（岁）25644012性别女性男性男性男性ALT、IU/L（参考范围：5–40）35382812AST、IU/L（参考范围：5-40）33362415胆固醇，mg/dL（参考范围：50–200）156195210120TG，mg/dL（参考范围：60–165）14514516595LDL，mg/dL（参考范围：最高 150）135165170110HDL，mg/dL（参考范围：> 40）35324023白细胞，109/L（参考范围：4000–10,000）118,000122,000141,000137,000红细胞，×106/μL（参考范围：4.2–6.2）4.55.25.34.8ESR，mm/1st h（参考范围：0–15）34429878FBS，mg/dL（参考范围：70–100）801259587尿素，mg/dL（参考范围：15–45）55312517肌酐，mg/dL（参考范围：0.6–1.4）2.10.91.10.7尿酸，mg/dL（参考范围：2.5–7.7）8.23