从序列设计到GMP生产：破局环状RNA产业化瓶颈

WHITE PAPER 从序列设计到GMP生产：破局环状RNA产业化瓶颈 一、为何选择环状RNA？超越线性RNA的优势 环状RNA（circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的单链RNA分子，其3’和5’端共价连接，形成无游离末端的完整环形结构。CircRNA独特的结构赋予了其超越传统线性mRNA的稳定性，其非凡的稳定性源于对核酸外切酶降解的抗性，使其半衰期显著延长，为长效蛋白表达奠定基础；同时，其闭合结构有助于避免被宿主模式识别受体（如RIG-I）识别，从而显著降低先天免疫反应，提升治疗安全性1。目前，环状RNA技术已经全面迈入临床验证期，证明了其可行性。 基于CircRNA结构所赋予的独特优势，其已成为新一代RNA技术。它不仅能实现持久、安全的治疗性蛋白表达，还可被设计为高效miRNA海绵或稳定RNA适配体，用于调控基因网络或干预疾病通路。 近期，该技术在体内CAR-T治疗领域取得了突破性进展。体外CAR-T细胞疗法需要个体化采集、细胞体外扩增和回输，流程漫长（3-6周）且成本高昂，极大限制了其治疗可及性。相比之下，基于CircRNA的体内CAR-T技术，利用其长效、稳定表达的特性，通过非病毒递送系统即可直接在患者体内原位生成CAR-T细胞。这一治疗策略展现出生产周期短，生产成本低，易于规模化生产，安全性优，可及性高等突出优势。 目前，基于CircRNA的体内CAR-T技术应用于自身免疫性疾病，B细胞恶性肿瘤等模型的最新研究数据，全面展示了CircRNA的应用潜力2。CircRNA有望为更广泛疾病的预防与治疗带来突破性进展。 二、CircRNA面临的双重设计挑战：体外环化策略与蛋白翻译效率 1.CircRNA体外环化策略：挑战与ProBio解决方案 目前，为满足生物医学研究和临床应用的需求，CircRNA的体外环化技术已发展出多种方法，主要包括酶法连接和核酶剪接法两大技术路线。 酶法连接 该方法是一种经典的体外环化方法。通过DNA或RNA"夹板"（splint）序列引导，利用T4 DNA连接酶或T4 RNA连接酶催化线性RNA前体的5’-磷酸末端和3’-羟基末端形成磷酸二酯键3。然而，其连接效率极易受RNA二级结构影响，导致长链RNA分子（>1000 nt）的环化效率通常较低，且易产生分子间连接的副产物，因此更适用于短链RNA的环化。 核酶剪接法 该方法（I型及II型内含子系统）模拟了天然的自剪接机制。通过核酶的特殊向导序列，使剪接位点在空间上相互靠近，实现精准环化。相对于酶法连接，核酶剪接法无需蛋白质酶的参与，可显著降低CircRNA生产成本。同时，该方法能够实现长链RNA的高效环化。因此，目前核酶剪接法已成为优选的CircRNA体外合成策略。 由于核酶自身的折叠构象容易受到目的环化序列干扰，导致环化效率不稳定，通用的优化策略为在剪接位点与目标环化序列之间插入间隔和底物增强序列以消除干扰4，从而实现环化效率提升，但这种设计方式会引入外源性的核酸序列，容易引发宿主先天免疫反应5,6。一种改良的核酶剪接法“无痕环化策略”通过将环化位点设计在目标环化序列中，从而完全消除外源性疤痕序列，但这种环化策略由于核酶缺乏间隔序列和底物增强序列的保护，其附近复杂的局部二级结构不利于核酶的正确折叠，导致核酶失去剪接活性，因此其环化率往往不稳定7。 针对上述技术瓶颈，ProBio体外环化平台构建了一个由自有环化专利技术驱动的全面的环化体系，提供三种体外环化解决方案，可精准匹配不同阶段与场景的应用需求。 有痕环化方案：基于成熟的自剪接自环化机制，通过引入底物增强序列提高环化率与稳健性。ProBio通过序列优化尽可能缩短底物增强序列的长度（可缩短至<10 nt），降低或消除其作为“疤痕”序列所引发的宿主免疫反应5。 在有痕方案的基础上，ProBio还提供两种无疤痕环化方案： 定制化无痕方案：该方法是一种完全定制化的环化路线，通过整合序列优化与智能位点筛选策略，可为任何目标序列（包括非编码RNA）设计无疤痕环化方案，尤其适合在早期研发阶段有特殊序列需求的研究（例如非编码CircRNA制备），但其环化效率需经湿实验验证，对过短或过长的序列存在适应性挑战。ProBio平台通过自由能计算与动态折叠模拟，预测并规避不利于环化的局部结构，同时提供多位点筛选服务，通过小规模实验确定最优环化条件，从而将单轮成功率提升至50%以上。 即插即用无痕方案：采用预筛选的环化元件与固定位点，具有“即插即用”特性，无需定制设计即可实现500-3000 nt蛋白表达型CircRNA的高效、无疤痕环化，并支持并行构建不同IRES和不同密码子优化的circRNA库，极大缩短筛选周期。 总体而言，ProBio的体外环化设计平台兼顾了通用性、稳健性与灵活性，用户可根据序列长度、应用场景（编码/非编码）以及对免疫原性的要求进行选择。 2.circRNA蛋白表达：挑战与ProBio解决方案 除环化策略外，如何提高CircRNA的蛋白表达效率也是CircRNA药物开发中所面临的重要挑战之一。与依赖于5’帽结构的mRNA不同，CircRNA则是通过功能元件IRES启动翻译。因此，其表达性能主要由IRES的性能与编码序列的密码子优化（常用CAI衡量）共同决定。然而简单地组合一个高性能的IRES和一个高CAI值的编码区并非最优，甚至可能不利于表达。IRES作为circRNA启动蛋白质翻译的关键元件，其功能高度依赖于形成正确的折叠构象，以有效招募核糖体启动翻译；但这种功能性构象易受编码区序列的干扰，破坏其结构完整性，反而导致翻译起始效率下降。 因此，理想的CircRNA设计需要对IRES构象稳定性与编码区翻译延伸速率进行协同优化。ProBio基于大量分子设计验证建立的CircRNA设计体系，可通过平衡两者在序列层面的制约关系，从而系统性显著提升CircRNA的整体表达性能8。 3.环状RNA生产与分析检测：挑战与ProBio解决方案 高效环化与高纯度产物的协同优化，是CircRNA在生产工艺方面的核心挑战。整个工艺流程涵盖体外转录（IVT）、环化、模板DNA去除、去磷酸化、纯化及除菌过滤等关键步骤。其中，环化反应的调控尤为关键。 环化效率受温度、反应液组分和时间等参数影响。环化反应过程中会伴随内含子核酶片段作为副产物产生。此外，环化效率不足会导致线性RNA前体（preRNA）残留，环化反应过度则引发CircRNA断裂，产生开环RNA（nicked RNA），开环RNA因其长度、序列与结构与CircRNA高度相似而极难实现分离和去除。 CircRNA制备过程中残留的RNA污染物是引发免疫反应的主要因素。线性RNA杂质中可能包含未去除的5’三磷酸基团，从而激活I型免疫反应，而开环RNA亦会被Toll样受体识别从而激活免疫反应1。因此，CircRNA的成环过程中所产生的杂质和副产物（线性前体、开环RNA、核酶片段等）给纯化工艺及纯度分析方法带来了双重挑战。 在纯化技术方面，现有策略各有局限：常用的酶法纯化策略（如RNase R消化）虽能有效去除线性杂质，但其对杂质的去除效率受RNA二级结构影响，对开环RNA去除效果有限，甚至可能因作用时间过长导致CircRNA本身降解；在层析纯化策略中，亲和层析依靠特殊标签设计，虽对preRNA，内含子片段等杂质捕获能力强、操作相对简单、杂质去除效率高，但同样无法有效去除开环RNA；反相色谱（RPC）虽能基于极性差异高效分离开环RNA，但过程中使用的有机溶剂可能影响产物活性并对生产设备（高压设备）和环境（如防爆）有特殊要求。 在纯度分析层面，对CircRNA样品中各组分的鉴别与精确定量需要采用高分离能力的分析方法，必要时甚至需要采用多种分析方法进行正交分析（CGE-PA800与RPIP-HPLC结合），才能充分表征环状RNA的纯度。 ProBio根据CDE发布的《预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（征求意见稿）》开发了针对CircRNA纯度分析方法（表1），图3展示了部分环状RNA样品的纯度分析案例，说明ProBio具有强大及稳健的分析平台可以解决环状RNA质量研究中所遇到的相关问题。 针对上述挑战，ProBio的CircRNA工艺分别从源头控制和纯化工艺两方面着手。首先，通过精细调控环化反应条件，旨在实现最大化环化效率（可达90%以上），并从根本最大限度减少开环RNA等关键杂质的产生。同时采用多维纯化策略，使用酶法或层析法显著提高circRNA纯度。 此外，ProBio通过对工艺简化和整合降低工艺复杂性从而减少样品损失，同时优化切向流过滤、层析纯化等步骤的工艺条件，以确保产品质量。最终，通过稳健的工艺过程控制和严谨的质量分析（确保有效去除线性RNA前体、开环RNA、DNA模板等杂质）获得高纯度、低免疫原性且满足GMP标准的CircRNA药物。 三、案例解析:从设计到生产- circRNA样品的生产与验证 案例1. CircRNA序列从头设计与工艺放大 在从头设计circRNA时，为了筛选获得高翻译活性的circRNA，使用“即插即用”无痕环化方案，将优选的IRES元件与经过不同密码子优化的编码序列进行组合，构建了5个circRNA前体，如图4所示，5个circRNA前体均实现了高效环化（环化反应粗产物中circRNA占比>60%），经纯化后circRNA纯度（PA800检测）可大于85%。与mRNA相比，经规模化生产的circRNA蛋白表达更高效，表现出更长的蛋白表达窗口（图6）。 (A) CircRNA序列设计与筛选流程；(B)不同CircRNA前体设计环化验证（环化反应粗产物）(C)序列筛选阶段CircRNA成品纯度；(D)基于体外细胞表达实验筛选最佳CircRNA前体 案例2.CircRNA-anti-CD19-CAR分子功能验证：高效且持久的蛋白表达 ProBio的CircRNA技术平台基于序列优化和体外环化策略，筛选到高效表达的CircRNA-anti-CD19-CAR，并进行了功能验证。 序列优化：基于ProBio的RNA序列优化平台对anti-CD19-CAR CircRNA序列进行优化，使用NeoLNP™ SDR2008转染Jurkat细胞进行筛选，优选序列阳性率显著提升，亦展现出更优的持续表达效果（图7A）。 蛋白表达评估：如图7B所示，与线性mRNA对照组相比，CircRNA-Anti-CD19-CAR分子表现出更持久的蛋白表达周期，其半衰期显著长于线性mRNA，这与circRNA结构稳定、可抵抗核酸外切酶降解的特性相符。 四、核心优势总结 ProBio的CircRNA平台从序列设计，工艺优化，质量控制构建“三位一体”的技术体系直面CircRNA产业化核心挑战与瓶颈，以序列设计确保效能及安全性，以工艺优化保障产品纯度与稳健的工艺放大，以严谨的分析质控策略进行多维度产品表征、功能性及安全性验证。 在序列设计层面，CircRNA即插即用的环化策略与AI辅助的环化位点预测模型，显著提升无痕环化率和筛选成功率。 针对CMC生产难题，高度整合的环化工艺，突破传统工艺纯度瓶颈（终产物纯度>80%，总回收率>40%，nicked RNA＜10%），成功适配CircRNA的生产需求。 在质量控制环节，基于IPRP-HPLC、CGE-PA800及CGE-5200的多维度检测体系，精准识别线性前体（preRNA）和开环RNA（nicked RNA）等关键杂质。 该平台已实现从实验室级别到GMP级生产的跨越式突破：在功能验证中，CircRNA在体外细胞中持续表达72-96小时，蛋白产量较线性mRNA提升。通过序列-生产-质控模块化设计，全面服务于体内CAR-T应用场景，CMC成本可控，具备多项目批生产交付经验，为治疗级CircRNA制品的规模化生产提供标准化范式。 参考文献 1.Wesselhoeft, R. A. et al. RNA circular