WHO BS 2023.2459 关于建立第二个 WHO SARS - CoV - 2 RNA 国际标准的合作研究

WHO / BS / 2023.2459 仅限英语生物标准化专家委员会日内瓦 ， 2023 年 10 月 16 日至 19 日建立 WHO 第二次 SARS - CoV - 2 RNA 国际标准的合作研究Emma M. Bentley1 ＃ ， Yann Le Duff2 ， Claire Ham3 ， Catherine Cherry1 ， Giada Mattiuzzo2 ， Jaqueline Fryer4 ， Clare Morris5 ， Jason Hockley6 ， Neil Almond3 ， Paul Stickings1 ， Peter Rigsby6 和协作研究组 *1 疫苗参考材料 ， 2 病毒疫苗 ， 3 诊断 ， 4 治疗参考材料 ， 5 市场分析 ， 制造和物流和 6 生物统计学组 ，英国药品和保健品监管机构 # 研究协调员 ， 电子邮件 ： emma. bentley @ mhra. gov. uk* 列于附录 1注:本文件是为了征求对其中包含的建议的意见和建议 ， 然后由生物标准化专家委员会 (ECBS) 审议。2023 年 10 月 2 日并应致函世界卫生组织 ， 瑞士日内瓦 1211 ， 注意 ： 技术 ， 标准和规范 （ TSS ） 。评论也可以电子方式提交给负责官员 ：Ivana Knezevic 博士电子邮件: knezevici @ who. int.© 世界卫生组织 2023保留所有权利。世界卫生组织的出版物可在世卫组织网站 （ www. who. int ） 上获得 ， 也可以从世界卫生组织出版社购买 ， 地址 ： 瑞士日内瓦 1211 阿皮亚大道 20 号 （ 电话 ： 41 22 791 ）3264 ； 传真 ： + 41 22 791 4857 ； 电子邮件 ： bookorders @ who. int) 。复制或翻译世卫组织出版物 — — 无论是出售还是非商业发行 — — 的许可请求应通过世卫组织网站向世卫组织出版社提出: (http: / / www. who. int / about / licensing / copyright _ form / en / index. html) 。本出版物中使用的名称和材料的呈现并不意味着世界卫生组织对任何国家、领土、城市或地区或其 WHO / BS / 2023.2459第 10 页2地图上的虚线代表可能尚未完全同意的近似边界线。提及特定公司或某些制造商的产品并不意味着它们得到世界卫生组织的认可或推荐 ， 而不是未提及的其他类似性质的产品。除错误和遗漏外 ， 专有产品的名称以首字母大写字母区分。世界卫生组织已采取所有合理的预防措施来验证本出版物中包含的信息。然而，发布的材料是在没有任何明示或暗示保证的情况下分发的。解释和使用材料的责任在于读者。在任何情况下，世界卫生组织都不对因其使用而造成的损害负责。仅指定作者负责本出版物中表达的观点。SummaryWHO ECBS 于 2020 年 12 月建立了首个 SARS - CoV - 2 RNA （ 20 / 146 ） 的 WHO 国际标准 （ IS ），以加快时间框架，以支持开发基于诊断核酸扩增技术 （ NAT ） 的检测方法来应对 COVID - 19 大流行。鉴于市场上有大量基于 NAT 的商业平台，对 First IS 的需求很高，库存接近枯竭。当前的监管格局和诊断感染的持续全球公共卫生重要性意味着对 IS 的需求将继续，并且需要在单位和可用性方面提供连续性。本报告描述了一项多中心合作研究的结果，以评估第二个 WHO IS 对 SARS - CoV - 2 RNA （ 22 / 252 ） 的候选物的适用性，并提出了国际单位分配。候选的 Secod WHO IS 已准备好成为同类替代品，包括 SARS - CoV - 2 的灭活的关注前变体 （ VOC ） 分离株。与第一个 WHO IS 和代表五个 VOC 的一组样品一起评估了性能。22 个实验室参与了这项研究，从 34 种方法中返回了 47 个数据集，其中 22 个基于商业平台。所使用的方法包括实时 PCR 、数字 PCR 、 TMA 、 LAMP 和 qSTAR 技术。相对于标准表达数据时，对实验室间变异性降低的评估表明，能够在分子技术范围内进行协调，而 VOC 之间没有明显差异。发现第一个和第二个候选 WHO IS 具有相似的表现。研究表明 ， 相对于标准报告 ， 定性和定量方法报告的数据之间的一致性得到了改善 ， 只有 0.01 对数10IU / mL 的平均效价差异为候选的第二个 WHO IS 相对于第一个 WHO IS 。因此 ， 建议将 22 / 252 确立为用于 NAT 测定的 SARS - CoV - 2 RNA 的第二个 WHO 国际标准 ， 指定效价为 7.50 Log10基于组合方法的 IU / 安瓿平均效力。 WHO / BS / 2023.2459第 11 页3Introduction自 2019 年 12 月报告首例严重急性呼吸道综合症冠状病毒 - 2 （ SARS - CoV - 2 ） 病例以及 2020 年 1 月世卫组织宣布国际关注的突发公共卫生事件 （ PHEIC ） 和 2020 年 3 月全球 COVID - 19 大流行以来，分子诊断检测的需求和实施是前所未有的。这最初是由早期获得的完整基因组序列的病毒 [1] 和世界卫生组织出版的内部 PCR 检测方案 [2] 迅速促进全球诊断检测能力的核酸扩增技术 （ NAT ） 。为了支持这些努力，WHO ECBS 于 2020 年 12 月建立了 SARS - CoV - 2 RNA （ 20 / 146 ） 的第一个 WHO 国际标准 （ IS ），并在加速的时间表下制定。通过校准到国际单位 （ IU ） 的分子诊断的标准化提供了一种重要的手段，通过该手段可以比较和控制用于检测 SRAS - CoV - 2RNA 的平台。向 IU 报告的数据的协调使得可以更好地定义参数, 例如分析灵敏度 / 检测限。在其成立之时，已经有超过 350 种基于 NAT 的产品投放市场，目前的数量仍然存在。在 > 700 [4] ， 因此对第一个世卫组织 IS 的需求很高 ， 在编写本报告时 ， 有 1, 800 多个小瓶分发给全球 400 多个最终用户 / 公司 ， 库存接近枯竭。COVID - 19 诊断前景仍然非常活跃，在可预见的未来，对 WHO IS 的需求可能会继续。随着世界卫生组织于 2023 年 5 月 5 日宣布 PHEIC [5] 结束，这启动了从紧急使用许可到传统资格预审评估途径的过渡期 [6] 。在全球范围内，监管机构可能会进入过渡期或调整 COVID - 19 分子设备立法。确认 COVID - 19 的临床诊断将通过基于 NAT 的方法检测 SARS - CoV - 2 特异性 RNA 来保持。此外，将继续积极监测和评估关注的循环变体 （ VOC ） 。因此，将需要 IS 的单位和可用性的连续性，并及时过渡到第二个 WHO IS，以支持对新平台和更新平台的持续评估和监管审查。2022 年 10 月，WHO ECBS 批准了替换 SARS - CoV - 2 RNA 的第一个 WHO IS 的提议。本报告描述了准备和多中心合作研究，以评估用于 NAT 测定的 SARS - CoV - 2 RNA 的第二个 WHO IS 。与第一个 WHO IS 一样，候选第二个 IS 基于灭活的前 VOC （ 武汉样 ） 分离株。尽管自 2022 年初以来，主要的循环变体已落入 Omicro 谱系下 [7]，但保持 IU 连续性和循环菌株内遗传多样性水平的重要性，以及分子诊断检测所有序列的要求，并不支持过渡到更新的菌株。然而，自第一个 WHO IS 成立以来，这项研究需要适应分子景观的变化。这包括包括一组灭活的 SARS - CoV - 2 VOC，以证明变体之间的协调，以及招募比替代研究通常需要的更广泛的参与者 （ 20 - 30 ），以捕获广泛的分子技术。 WHO / BS / 2023.2459第 10 页4这项合作研究的目的是 ： 在不同实验室进行的一系列典型测定中 ， 与第一个 WHO 国际标准平行评估候选物的效力 / 读数。 表征候选物在不同测定系统中的反应性 / 特异性。 评估可交换性, 即确定候选物适合用作多种不同样品 / 菌株的标准的程度。 为第二份世卫组织国际标准提出一个单位 ， 以确保国际单位使用的连续性。材料和方法候选标准候选替代标准 (NIBSC 代码 22 / 252) 包括灭活的 SARS - CoV - 2 (pre - VOC) 分离物的冻干制剂。病毒块是使用 BetaCoV / Astralia / VIC01 / 2020 分离株 （ Geba 登录号 MT007544.1 ） 制备的，该分离株由皇家墨尔本医院 （ 澳大利亚 ） 的维多利亚传染病参考实验室捐赠给 MHRA 。该病毒在第 3 代在 MHRA 处接受, 并在 Vero / hSLAM (ECACC # 04091501) 中以 0.001 的 MOI 再扩增一次传代, 并在接种后 72 小时收获。病毒块的感染滴度测量为 2.15 X107TCID 。50/ mL 通过 Vero - E6 细胞 (ATCC ® CRL - 1586) 上的终点滴定。使用衍生自 Moore 等人中描述的方法的方案进行下一代测序 (NGS) 。[8] 确认繁殖批次病毒的遗传完整性。在使用 QIAamp 病毒 RNA 迷你试剂盒 （ Qiage ＃ 52904 ） 提取病毒 RNA 后，使用 Sperscript IV 第一链 cDNA 合成试剂盒 （ ThermoFisher ＃ 18091050 ） 产生 cDNA，并使用 Q5 高保真 2x 主混合物 （ NEB ＃ M0492S ） 进行 PCR 。使用 AMPreXP 珠子 (BecmaColter # A63880) 纯化扩增子, 并使用 IllmiaDNA NexteraFlex 产生测序文库。在 Illmia MiSeq 上对文库进行测序，并使用 ivar 和 lofreq 变体调用者作为内部开发的生物信息学管道的一部分，针对武汉 - 1 参考序列 （ Geba 登录号 NC _ 045512.2 ） 调用变体。附录 2 提供了变化表。使用经验证的酸热处理方案 (在附录 3 中详细描述) 进行病毒的灭活。简而言之, 将病毒培养物用 3% v / v 乙酸孵育 15 分钟, 并通过添加氢氧化钠中和, 然后在 60 ° C 下孵育 1 小时。通过在 3 周的时间内在高度易感的 Vero - E6 / TMPRSS2 细胞系 (NIBSC # 100978) 中将 10% 的原液传代 3 次来验证病毒原液的失活, 以及阳性和阴性对照。监测细胞的细胞病变征象。 WHO / BS / 2023.2459第 11 页5Effect and culture media tested for any quanitable increase in virus RNA by RT - qPCR. No villing virus was detected. The inactivation procedure was approved by the MHRA Biological Safety Committee.为了配制大量的 22 / 252 以准备填充, 使用 Amico ® Ultra50Da 离心过滤柱纯化灭活的病毒培养物, 并重悬于通用缓冲液 (10mMTris - HCl (pH7.4) 、 0.5% 人血清白蛋白和 1% D - (+) - 海藻糖脱水物) 中。通过使用引物 / 探针靶向 E 基因的内部 RT - qPCR，相对于第一个 WHO 国际标准 20 / 146 （