外源性人 α-突触核蛋白在体外作为温和的血小板抗聚集剂，抑制 α-凝血酶诱导的血小板活化

科学报告|(2022) 12:9880| https://doi.org/10.1038/s41598-022-12886-y1 打开外源人α-突触核蛋白在体外作为温和的血小板抗聚集剂，抑制 α-凝血酶诱导的血小板活化Laura Acquasaliente1,9, Giulia Pontarollo1,6,9, Claudia Maria Radu2,3,9, Daniele Peterle1,7, Ilaria Artusi1, Anna Pagotto1, Federico Uliana1,8, Alessandro Negro4, 保罗·西蒙尼 3 & Vincenzo De Filippis1,5α-突触核蛋白 (αSyn) 是一种小的无序蛋白，在脊椎动物中高度保守，参与帕金森病 (PD) 的发病机制。事实上，αSyn 淀粉样蛋白聚集体存在于PD患者的大脑。尽管 αSyn 的致病作用被广泛接受，但这种蛋白质的生理功能仍然难以捉摸。在中枢神经系统之外，αSyn 表达在造血组织和血液中，血小板是 αSyn 的主要细胞宿主。血小板在止血中起关键作用，并通过蛋白酶激活受体的切割被凝血酶 (αT) 有效激活。此外，αT 和 αSyn 都可以在同一个空间中找到环境，即血小板膜，因为 αT 结合并激活血小板，血小板可以从 α-颗粒和微泡中释放 αSyn。在这里，我们研究了外源性 αSyn 可能干扰体外不同激动剂诱导的血小板活化的可能性。从不同的实验技术（即多电极聚集度测定法、旋转血栓弹性测定法、免疫荧光显微镜、表面等离子体共振和稳态荧光光谱法）获得的全血和富含血小板血浆的数据表明，外源性 αSyn 在体外具有温和的血小板抗聚集特性，作用通过优先抑制血小板表面的 P-选择素表达，作为 αT 介导的血小板活化的负调节剂。我们还表明外源性和内源性（即细胞质）αSyn 都优先结合活化血小板的外表面。从这些发现出发，提出了αSyn 抗血小板功能的连贯模型。α-突触核蛋白 (αSyn) 是一种小酸性蛋白（140 个氨基酸；~ 14 kDa），在脊椎动物中高度保守，脑黑质多巴胺能神经元中存在 αSyn 淀粉样蛋白聚集体是脑黑质的关键神经病理学标志。帕金森病 (PD) 391. αSyn 是一种结构无序的单体蛋白，在溶液中分离时3 在蜂窝环境中，它呈现松散的动态结构4. αSyn 的一级结构显示了三个不同的区域（图 1）：（i）N 末端区域（NT，氨基酸 1-60）具有高正电性，用于优先将 αSyn 定位到带负电荷的区域1 帕多瓦大学医学院药物和药理科学系蛋白质化学和分子血液学实验室，via Marzolo, 5, 35131 Padua, Italy。 2意大利帕多瓦帕多瓦大学妇女和儿童健康系。 3 帕多瓦大学医学系血栓和出血性疾病科，via Giustiniani, 2, 35128 Padua, Italy。 4帕多瓦大学生物医学科学系，viale G. Colombo 3, 35100 Padua, Italy。 5生物技术中心，CRIBI，帕多瓦大学，帕多瓦，意大利。 6现地址：德国美因茨 Langenbeckstraße 1, 55131 Mainz 血栓形成和止血中心 (CTH) 大学医学中心。 7现地址：美国马萨诸塞州波士顿市亨廷顿大街 360 号 02115 号东北大学化学与化学生物学系。 8现地址：分子系统生物学研究所，苏黎世联邦理工学院，8093 Zurich，Switzerland。 9 这些作者的贡献相同：Laura Acquasaliente、Giulia Pontarollo 和 Claudia Maria Radu。电子邮件：alessandro.negro@unipd.it； paolo.simioni@unipd.it； vincenzo.defilippis@unipd.it 科学报告|(2022) 12:9880 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12886-y2一个NH21乙60 6195 96140二氧化碳图1。域架构（一个) 和氨基酸序列 (乙) 的人类 αSyn。 NT：N-末端结构域区域（氨基酸 1-60）带正电荷（pI：9.4）并在脂质膜表面呈现螺旋构象。 NAC：非淀粉样蛋白 α 组分（氨基酸 61-95）具有高度疏水性，具有很强的 β-折叠构象倾向，并介导 αSyn 聚集/原纤维化。 CT：C 末端结构域（氨基酸 96-140）呈强阴性（pI：3.1）。生物膜5; (ii) 对应于非淀粉样蛋白 β 组分（NAC，氨基酸 61-95）的中心区域本质上是疏水性的，对纤颤至关重要6; (iii) C 末端区域（CT，氨基酸 96-140）显示出高负电势，负责将 αSyn 与几种靶蛋白结合7.超过临界浓度 (~ 30 μM) 并在体外长时间孵育后，αSyn 聚集形成淀粉样蛋白原纤维8, 以交叉β折叠结构为特征9.虽然 αSyn 参与 PD 的发病机制已被广泛接受，但该蛋白的正常生理功能尚未完全阐明10. αSyn 大量存在于人体中枢神经系统中11在神经元细胞和突触前末端的细胞核中，它与突触小泡结合并调节小泡稳态和突触可塑性11.除了中枢神经系统，还在造血组织和血液中测量到显着的 αSyn 表达水平（~ 1 μM；~ 15 mg/l）13.绝大多数血液 αSyn 存在于红细胞中 (> 99%)，因为红细胞是迄今为止最丰富的血液细胞成分，而剩余的量则分为血浆 (0.1%)、白细胞 (0.05%) ) 和血小板 (0.2%)。后者是血液中αSyn的主要细胞宿主17，每毫克总蛋白质含有 264 ± 36 ng αSyn，是红细胞中储存量的两倍（即每毫克总蛋白质 131 ± 23 ng）17.在鼠巨核细胞中发现了编码 αSyn 的 mRNA18，而在巨核细胞分化为血小板期间αSyn水平增加14.早期的细胞定位研究表明，αSyn 大量存在于静息血小板的细胞质中，与分泌的 α-颗粒膜、质膜的内叶有关14，以及在血小板细胞外微泡中21.在血管壁损伤后，血小板会发生一系列高度调节的功能反应，包括：(i) 粘附，(ii) 扩散，(iii) 释放反应，(iv) 聚集，(v) 促凝剂表面的暴露，(vi)微粒形成，和 (vii) 凝块收缩22.所有这些血小板反应协同作用，在血管损伤部位迅速形成止血栓，以防止失血。更具体地说，血小板在原发性止血中发挥核心作用，粘附于血管损伤后暴露的胶原蛋白和血管性血友病因子 (VWF) 等内皮下基质蛋白并被其激活22. VWF 与血小板表面上的糖蛋白 (Gp) Ib/IX/V 复合物结合介导初始血小板粘附。然后血小板开始减速并暂时粘附在血管壁上。胶原蛋白与血小板 GpVI 结合导致细胞活化，随后牢固粘附并通过活化的受体 GpIIb/IIIa 和 α2β1 扩散。血小板粘附还触发细胞内信号传导和血小板活化，导致 (i) 脱粒，释放 ADP、5-羟色胺和 Ca2+来自致密颗粒和 VWF、纤维蛋白原、凝血因子和来自 α 颗粒的跨膜糖蛋白 P-选择素，(ii) 血栓素的合成/释放，(iii) 血小板表面 GpIIb/IIIa 复合物的活化，(iv) 暴露阴离子磷脂酰丝氨酸和 (v) 促凝血微泡的产生。然后，血小板活化促进血小板从血流中进一步局部募集，导致由纤维蛋白原介导的血小板聚集和 VWF 桥接在相邻细胞上的活化 GpIIb/IIIa 之间。阴离子磷脂的暴露提供了一个带负电荷的表面，在 α-凝血酶 (αT) 生成和纤维蛋白形成的放大和传播阶段，血小板可以在其上支持凝血因子复合物组装和活化（即 Tenase 和凝血酶原复合物），结果-用于稳定随后的止血塞22.值得注意的是，αT 是体内最有效的血小板激活剂，可切割血小板表面的两个 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 的外域，即 1 型和 4 型蛋白酶激活受体（即 PAR1 和 PAR4）22. αT 还以高亲和力结合糖蛋白 Ib (GpIb) 的 α 链，这是一种“富含亮氨酸的重复”受体蛋白，与血小板表面的 GpV 和 GpIX 形成非共价复合物25.更具体地说，GpIbα 带负电荷的 C 末端尾部与 αT 带正电荷的外部位点 2 结合26 并将蛋白酶外位点 1 定向为与 PAR1 外域的有效相互作用（和切割）。结果，GpIbα 增强了 αT 诱导的 PAR1 蛋白水解激活的 5 倍以上27.裂解后，新生成的 N 末端充当 PAR1 的分子内激活剂，导致脱粒以及活化血小板典型的形态和功能变化。与这些相关MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDPDNEAYEMPSE EGYQDYEPEA102030405060708090100110120130140新台币NAC电脑断层扫描 科学报告|(2022) 12:9880 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12886-y3事件是跨膜糖蛋白 P-选择素 (CD62P) 在血小板表面的暴露，这是血小板活化的标志，主要由 αT 和非蛋白水解 PAR1 激动剂引起，例如 TRAP6（即凝血酶受体激活肽 6，对应于栓系 PAR1 区域 SFLLRN-NH2 的 N 端部分）28.与 αT 不同，adenosine-5′-二磷酸盐（ADP）通过直接与 P2Y12 受体（即血小板膜上 ADP 的主要 GPCR）相互作用而弱激活血小板，降低 cAMP 浓度并增加细胞溶质 Ca2+, 最终血小板形状改变和激活22.PD患者的血浆αSyn浓度显着高于健康个体30在 PD 患者中描述了异常的血小板形态（即较大的血小板）19，以及 PD 血小板在 αT 和 ADP 刺激后聚集的趋势降低36.有趣的是，PD 患者的缺血性中风、心肌梗死和冠状动脉疾病的发生率明显低于健康对照组37.相反，在缺乏 αSyn 的 α-syn-/- 基因敲除小鼠中报道了较小的血小板、P-选择素的血小板膜表达增加和普遍的高凝表型19.从这些知识开始，考虑到 αT 和 αSyn 可以在血小板表面共定位（因为 αT 结合并激活血小板，血小板也是 αSyn 的主要细胞储存库），我们决定研究外源性 αSyn 对来自健康受试者的血小板（分离的和全血中的）在用不同的激动剂（即 αT、凝血酶受体激活肽 6 (TRAP6) 和 ADP 刺激后）的聚集。我们的结果表明，外源性 αSyn 在体外可以作为弱血小板抗聚集剂，主要通过干扰 αT-PAR1 功能轴。还讨论了这些发现可能产生的生理影响。结果重组αSyn物种的生产和表征。全长人 α-突触核蛋白 (αSyn, 氨基酸 1-140)、相应的 N 端 6xHis 标记衍生物 (6xHis-αSyn)、截短物种 6xHis-αSyn(1-96) 和融合突变蛋白 αSyn- GFP，其中绿色荧光蛋白 (GFP) 的多肽链序列与 αSyn 的 C 末端融合，在大肠杆菌细胞中表达，如前所述42，并以其纯度和单体状态为特征，如补充图S1和表S1中所述。αSyn 及其衍生物对血小板活化/聚集的影响通过多电极聚集测定法、旋转血栓弹性测定法和流式细胞术研究。多电极聚合法 (MEA)。使用 TRAP6、αT 或 ADP 作为血小板激活剂，通过 MEA 分析对全血 (WB) 和洗涤过的血小板进行了全长 αSyn 及其 N 端和 C 端截短种类浓度的增加对血小板聚集的影响。图 2）。 MEA是一种快速且特异性的血小板功能测试方法44, 广泛用于基础血液学研究和临床测试，不仅可以选择性测量富血小板血浆 (PRP) 或分离的血小板中的血小板聚集，如经典的光透射聚集测定法 (LTA)，还可以用于 WB，这是体内发生血小板功能的生理环境45（另见“方