果蝇强迫游泳试验的验证，以及它用于证明裸盖菇素在果蝇中具有持久的抗抑郁样作用

科学报告|(2022) 12:10019| https://doi.org/10.1038/s41598-022-14165-21 打开强制游泳的验证在果蝇中进行测试，及其用于证明裸盖菇素在苍蝇中具有持久的抗抑郁样作用M. Hibicke & C. D. Nichols在人体临床试验和啮齿动物模型中，赛洛西宾已被证明是一种强大、持久的抗抑郁药。虽然啮齿动物通常被用来模拟精神疾病，果蝇具有类似于哺乳动物的神经递质系统和许多类似行为的类似大脑结构。强制游泳试验 (FST) 已被广泛用于评估化合物的抗抑郁功效，最近已适用于果蝇。苍蝇 FST 有可能成为一种具有成本效益的高通量检测方法，用于评估潜在的抗抑郁药。在这项研究中，我们使用甲基苯丙胺、DL-α-甲基酪氨酸和抗抑郁药西酞普兰对苍蝇 FST 进行了药理学验证。虽然甲基苯丙胺和 DL-α-甲基酪氨酸发生了改变果蝇活动监测系统 (DAMS) 中的整体运动活动，它们对 FST 中的不动性测量没有显着影响。相反，慢性西酞普兰减少措施在不增加 DAMS 活动的情况下，两性在 FST 中保持不动。我们使用经过验证的 FST 来评估高 (3.5 mM) 和低 (0.03 mM) 裸盖菇素剂量的抗抑郁样作用。两种剂量的裸盖菇素都显着降低了雄性果蝇的不动性指标，但对雌性果蝇没有影响。0.03 mM 的效果大小与慢性西酞普兰相当，3.5 mM 的效果大小约为慢性西酞普兰的两倍。大鼠通常用于人类疾病状态的行为模型，并且传统上首选用于模拟精神疾病1.尽管在行为范式方面功能强大，但大鼠模型尚未开发用于广泛的遗传重塑，而经典遗传模型黑腹果蝇已被开发2.果蝇神经递质系统与哺乳动物系统非常相似3, 他们有许多相似的大脑结构参与相似的行为4，并且许多已知影响哺乳动物行为的基因在果蝇中存在并发挥相同的功能5.跨门神经递质系统的保护表现为对药物的相似反应6, 但果蝇尚未完全用于潜在药物疗法的高通量行为筛选。强迫游泳测试 (FST) 是一种行为绝望范式，常用于大鼠测量应对不可避免的逆境的应对策略，其中被动应对策略（不动）被解释为类似抑郁症，而减少不动则为类似抗抑郁药的证据影响7. FST 可用于筛选给予其他健康大鼠的药物的抗抑郁作用8，用于抑郁症动物模型中的被动应对策略10，或用于研究抑郁症的动物的抗抑郁药样作用11.虽然缺乏对 FST 行为的神经回路特异性调节会降低转化价值，但由于行为性别二态性，FST 是雄性和雌性大鼠抑郁样行为最可靠的测量方法9.此外，该分析显示出强大的面部和预测有效性，因为人类抑郁症的风险因素已被反复证明会增加 FST 的不动性11，而抗抑郁疗法可有效减少人类抑郁症，也可减少 FST 中的不动8.由于 FST 测量主动和被动应对策略，它可能会被影响整体活动水平的药物的非特异性镇静或兴奋作用混淆7.例如，精神兴奋剂安非他明增加啮齿动物 FST 的活跃行为以及整体运动活动，抗精神病镇静剂氯丙嗪增加美国路易斯安那州新奥尔良路易斯安那州立大学健康科学中心药理学和实验治疗学系。电子邮件：cnich1@lsuhsc.edu 科学报告|(2022) 12:10019 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14165-22在 FST 中不动，同时降低整体运动活动。然而，抗抑郁药物选择性地增加 FST 中的活动行为而不增加整体运动活动7.因此，任何对推定抗抑郁药作用的研究都需要评估整体运动活动，以排除非特异性兴奋剂作用的混淆。最近，强制游泳测试 (FST) 已适用于果蝇16.有证据表明，暴露于特定压力源的果蝇在 FST 中表现出增加的不动性，而运动活动没有整体降低16，建议苍蝇 FST 的面部有效性作为行为绝望的衡量标准，被动应对策略被解释为抑郁样行为。然而，FST 的苍蝇适应尚未经过药理学验证的预测有效性。如果经过验证，苍蝇 FST 可能成为阐明抗抑郁药物作用的药理学机制以及描述将被动应对策略转变为主动应对策略所涉及的神经回路的有力工具。此外，它有可能成为一种极具成本效益的高通量筛选试验，用于对潜在药物疗法的抗抑郁样作用进行行为评估，例如迷幻药，如裸盖菇素。迷幻研究目前正在复兴。代表性化合物已被证明是强大的、持久的人类抗抑郁药19, 具有抗抑郁作用13 并减少啮齿动物的炎症23, 并增加幼虫果蝇和啮齿动物神经元细胞培养的神经可塑性26.在这项研究中，我们使用精神兴奋剂甲基苯丙胺 (METH)、功能性镇静剂 DL-α-甲基酪氨酸 (αMT)、已建立的选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂 (SSRI) 抗抑郁药西酞普兰 (CIT) 从药理学上评估苍蝇 FST 的预测有效性，以及迷幻前药裸盖菇素 (PSI)、5-HT1A 受体拮抗剂 WAY 100635 (WAY) 和 5-HT2 受体拮抗剂酮色林 (KET)。 METH 通过逆转钠依赖性多巴胺、去甲肾上腺素和血清素转运蛋白的转运方向来增加突触活动，并增加果蝇的运动活动27. αMT 抑制酪氨酸羟化酶，导致儿茶酚胺耗竭，并降低果蝇的运动活性28. CIT 选择性抑制钠依赖性血清素受体 (SERT)，并已显示与果蝇中的 SERT (dSERT) 结合29.赛洛西宾被碱性磷酸酶转化为其活性代谢物赛洛辛。 Psilocin 与 5-HT2A 受体具有高亲和力，而与其他血清素能受体（包括 5-HT1A）的亲和力较低。酮色林和 WAY 100635 均已被证明在果蝇中具有生物活性30，并用于探索裸盖菇素影响运动活动的药理机制。结果强迫游泳行为和整体运动活动因性别、应变和药物反应而异。果蝇活动监测系统 (DAMS) 用于测量随时间变化的运动活动，而苍蝇强迫游泳试验 (FST) 用于测量两种实验室标准野生型 Canton-Special 的 6 天龄雄性和雌性的不动行为。 CS) 不同血统的苍蝇。苍蝇在载体培养基上喂食 5 天或脉冲剂量的裸盖菇素，其中苍蝇以载体培养基中的裸盖菇素（0.03 mM）喂食 1 天（1×），然后用载体培养基喂食 4 天（图 1） ）。在 DAMS 中，自变量性别（男性、女性）和治疗（车辆、PSI）的双向方差分析0.03 mM）发现性别和治疗之间存在显着的相互作用（p < 0.0001），以及由于性别（p < 0.0001）和治疗（p < 0.0001）引起的显着变化。 CSX喂食载体培养基的女性 (p < 0.0001) 和男性 (p < 0.0001) 比同性 CS 更活跃CLWU对应物（图 2A）。两者都是 CSX(p < 0.0001) 和 CSCLWU(p < 0.0001) 男性的活跃度明显低于同株女性。 PSI (0.03 mM) 增加 CS 中的运动活动X女性 (p < 0.0001)，但在 CS 中没有X男性或 CSCLWU苍蝇。没有观察到其他相关差异。在 FST 中，自变量性别（男性、女性）和应变（CSX， CSCLWU) 发现性别和应变 (p = 0.0306) 之间存在显着的相互作用，以及由于性别 (p = 0.0249) 和应变 (p < 0.0001) 引起的显着变化。 CSCLWU男性比 CS 更不能移动CLWU女性 (p = 0.0115) 和 CSX男性 (p < 0.0001)，但在男性和女性 CS 之间没有观察到差异X苍蝇（图2B）。 CSX女性 (p = 0.0007) 和男性 (p < 0.0001) 的不动次数明显少于同性 CSCLWU对应物（图 2B）。没有观察到其他相关差异。作为 CSCLWU给予 0.03 PSI (1×) 的果蝇在 FST 中更加不动，并且没有增加它们在 DAMS 中的整体运动活动，选择该菌株进行额外的实验。此外，作为男性 CSCLWU苍蝇明显（并且始终）比雌性苍蝇更不动，在随后的 FST 分析中独立评估了性别。强迫游泳中的不动性与整体运动活动无关，并且因西酞普兰而降低。通过比较雄性和雌性 CS 的不动行为来评估苍蝇 FST 的预测有效性CLWU在测试 FST 中的不动行为之前，苍蝇在载体培养基中喂食 5 天 (5x) 或载体培养基中的药物。将 FST 行为与第五天在以载体培养基或载体培养基中的药物喂养的苍蝇的 DAMS 中的整体运动活动进行比较（图 1）。使用的药物是 METH (5.0 mM)、αMT (3.0 mM) 和 CIT (0.3 mM、1.0 mM、2.5 mM)。自变量性别（男性，女性）和治疗（车辆，METH）的双向方差分析发现性别和治疗之间存在显着的相互作用（p = 0.0003），以及两性引入的显着差异（p <0.0001）和处理 (p < 0.0001)。喂食载体培养基的男性明显低于喂食载体培养基的女性（p < 0.0001）。 METH 显着增加了男性（p < 0.0001）和女性（p < 0.0001）的运动活动（图 3A）。没有观察到其他相关差异。自变量性别（男性，女性）和治疗（车辆，αMT）的双向方差分析发现性别和治疗之间存在显着的交互作用（p = 0.0268），以及性别引起的显着变化（p < 0.0001）和治疗（p < 0.0001）。饲喂载体培养基的雄性显着低于饲喂载体的雌性 科学报告|(2022) 12:10019 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14165-23图1。脉冲（1×）和慢性（5×）给药的实验设计。将一天大的雄性和雌性果蝇分别放入透明管中，管的一端用一团松散的棉花塞住，另一端用透明的食物培养基和塑料帽塞住。食物培养基是载体、METH (5.0 mM)、αMT(3.0 mM)、CIT (0.3、1.0 或 2.5 mM)、PSI (0.03 mM、3.5 mM)、KET (1.0 mM) 或 WAY (1.0 mM)。 1×表示在组条件下，苍蝇被喂食处理食物 24 小时，然后转移到含有载体培养基的管中（如上所述）。 5×表示如上所述连续5天用管中的处理食物喂食苍蝇。苍蝇被放入 DAMS 中，每组 n = 16，每个治疗组中的每种性别，并在恒定光照条件下保持至少 5 天，同时进行监测。所有其他苍蝇在恒定光照条件下保持 5 天，然后在 FST 中进行测试，以便每个治疗组中每种性别的 n = 7，但 FST 中的各个数据点代表 16 只苍蝇的平均行为。对于每个治疗组（112/组），总共使用 896 只苍蝇为雄性 (448) 和雌性 (448) 生成 n = 7。中等（p < 0.0001）。 αMT 显着降低了男性（p < 0.0001）和女性（p < 0.0001）的运动活动（图 3B）。没有观察到其他相关差异。自变量性别（男性、女性）和治疗（车辆、0.3、1.0 和2.5 mM CIT) 发现性别和治疗之间存在显着的相互作用 (p < 0.0001)，以及性别 (p < 0.0001) 和治疗 (p < 0.0001) 引入的显着差异。喂食载体培养基的男性明显低于喂食载体培养基的女性（p < 0.0001）。 2.5 mM CIT 显着降低了女性的运动活动（p < 0.0001），但在各组之间没有观察到其他差异。选择 1.0 mM 用于 FST（图 2C）。由于男性在 DAMS 中的基线活动始终明显不那么活跃（图 2a、3a-c），因此使用单向方差分析独立评估了性别的 FST 行为。 CIT 显着降低了男性的不动 (p = 0.0137)，增加了女性 (p = 0.0227) 和男性 (p = 0.0051) 首次不动的潜伏期，并减少了男性的不动发作 (p = 0.0285)。与载体相比，METH 或αMT 在任何结果测量中均未观察到显着差异（图 4）。对裸盖菇素的总体运动反应因性别、剂量和给药策略而异。为了评估 PSI 对 DAMS 中整体运动活动的影响，PSI (0.03 mM, 3.5 mM) 被脉冲施用 (1x) 以与临床试验中抗抑郁作用的给药策略一致21并在与老鼠的研究中13.自变量性别（男性，女性）和治疗（车辆，PSI 3.5 mM，