对胎儿毛滴虫转录组学的深入比较分析揭示了与猫宿主适应相关的新基因

科学报告|(2022) 12:10057| https://doi.org/10.1038/s41598-022-14310-x1 打开深入对比分析胎儿毛滴虫转录组学揭示了与猫宿主适应相关的新基因安德烈斯 M. 阿隆索1,4, Nicolás Schcolnicov1,4, Luis Diambra2 & Veronica M. Cóceres3,4胎儿毛滴虫是一种有鞭毛的寄生虫，能够感染牛、猫和猪。尽管猫毛滴虫病很普遍，但它受到的关注明显少于性病感染，并且关于参与猫宿主感染的分子机制的信息很少。通过生物信息学方法，我们整合了三个公共转录组数据T. fetus 分离物并探讨了转录水平的差异，重点是发病机制和适应过程，特别是猫分离物。我们的分析揭示了更高丰度水平的预测毒力因子，例如蛋白酶和表面抗原。此外，通过对 T. fetus 基因的比较和表达分析，我们提出了可能与猫科动物感染有关的假定毒力因子。最后，我们确定了 MYB 蛋白家族的大部分预测转录因子，并且通过启动子分析，我们揭示了 MYB 相关蛋白可以参与 T. foetus 基因转录的调节。总之，这种综合方法是未来研究宿主-病原体相互作用和确定新基因靶标以改善猫毛滴虫病诊断和治疗的宝贵资源。Parabasalia 是一种有鞭毛的原生动物门，其中几种是动物和人类中的重要寄生虫1. T. foetus，来自毛滴虫纲和毛滴虫目，已被描述为在不同动物宿主中发现的病原体2.这种原生动物寄生虫是牛中一种重要的性病病原体，可导致女性子宫内膜炎、早期胚胎死亡和暂时性不育。相比之下，T. fetus 感染回肠、盲肠、结肠，并被认为是家猫大肠腹泻的主要原因4.此外，T. fetus 被描述为一种猪寄生虫，存在于猪宿主的鼻道、胃、盲肠和结肠中3.虽然没有记录可区分的 T. fetus 分离物的形态差异，但分子研究证实 T. fetus（牛）和 T. suis（猪）属于同一物种，并被认为是同义词7.在这种情况下，全基因组测序 (WGS) 研究揭示了猫、牛和猪分离物之间的显着差异，但数据并未证实猫分离物是不同的物种。此外，用于比较转录组学和蛋白质组学分析的高通量技术显示分离株之间没有分子水平差异，这表明猫、牛和猪分离株可能属于同一物种8.考虑到 T. fetus 分离株之间的遗传差异是一致的，但不足以将牛、猪和猫分离株定义为不同的物种，我们在基因表达水平上分析了 T. fetus 分离株之间的差异，重点关注已知的致病因素这可能与不同宿主中的 T. fetus 致病机制有关。尽管对滴虫的致病机制知之甚少，但有人提出宿主环境中的动态条件会影响滴虫感染14.从这个意义上说，已经报道了 T. fetus 分离株之间半胱氨酸蛋白酶表达谱的差异，这导致假设寄生虫基因表达的生态位/宿主环境的影响。12.1 Chascomús 技术研究所 (INTECH) 分子寄生虫学实验室，CONICET-UNSAM，Intendente Marino km 8.2, 7130 Chascomús，阿根廷布宜诺斯艾利斯省。 2CREG，拉普拉塔国立大学-CONICET，拉普拉塔，阿根廷。 3厌氧寄生虫实验室，Chascomús 技术研究所 (CONICET-UNSAM)，Chascomús，阿根廷。 4 生物和纳米技术学院 (UNSAM)，阿根廷查斯科穆斯。电子邮件：amalonso@intech.gov.ar； coceres@intech.gov.ar 科学报告|(2022) 12:10057 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14310-x2尽管它广泛流行并且缺乏有效的治疗方法，但在研究与发病机制和宿主相互作用相关的分子方面，猫 T. fetus 受到的关注远少于性病滴虫病。在这种情况下，有人提出对肠上皮的粘附依赖于受体-配体相互作用，并且据报道，半胱氨酸蛋白酶与这种寄生虫在猫宿主中的细胞毒性有关。15.在这里，我们通过生物信息学分析整合了可用的 T. fetus 转录组学信息，以探索 T. fetus 分离株在基因表达水平上的差异，主要考虑可能导致猫分离株发病机制的已知分子因素。利用 T. fetus K1 菌株的基因组草图组装17，我们为三个公开可用的转录组学数据生成了引导转录组组装：PIG30/1（猪）、G10/1（猫）和 BP-4（牛）分离株。我们确定了表达转录物的丰度，证实了 BP-4 和 PIG30/1 之间的巨大相似性，以及与 G10/1 相关的那些分离物的显着差异。使用比较程序，我们发现了一组主要在 G10/1 中表达的致病因子，预计这些致病因子可编码为 BspA 样蛋白、四跨膜蛋白、金属蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶、钙蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶和 Myb -样DNA结合蛋白（MYB），这些最后在其他病原体中被认为是关键转录因子。最后，我们揭示了 G10/1 分离株中 MYB 蛋白的表达模式，通过计算机启动子分析，我们观察到序列中存在 DNA 基序，这表明这些转录因子可能参与了 T 中的基因转录调控。胎儿。方法数据采集和分析。来自 T. fetus 分离物的 RNA 测序原始数据：猪 (PIG30/1; SRX973684)18, 牛 (BP4; SRX540117) 和猫 (G10/I; SRX540971)11，从序列读取存档数据库中获得19.这些数据集不包含生物复制品，这妨碍了基因表达的差异分析。质量检查由 FASTQC 工具执行20 并通过trimmomatic软件过滤读数21.使用 HISAT2 比对工具将存活的读数与 T. fetus K1 参考基因组 (ASM183968v1) 比对22.组装每个序列实验的映射读数，并使用 cufflinks 软件计算转录本丰度 (FPKM)23(T. fetus K1 作为参考)。通过 cuffmerge 脚本合并生成的程序集以获得三个测序样本的通用转录组23. cummeRbund 包对 R 执行了结果检查24.保留其中一种菌株中至少 FPKM > 1 的转录本，并将伪计数 = 1 添加到所有数据集中以进行进一步的探索性分析。使用 R 函数和自定义脚本构建主成分分析和散点图。对于维恩图，每个分离株 FPKM > 1 的转录本被保存为独立的集合，用于进一步比较和使用 R 自定义脚本构建图。补充表 S1 列出了本工作中使用的三个分离株的每个转录本的 FPKM 值。成绩单注释程序。来自合并转录组的转录序列（重叠群）通过 transeq 工具翻译成 6 个阅读框25.每个转录本的最长翻译序列 (100 aa) 被保留并用作使用 interproscan 工具进行大规模注释过程的输入26.只有 pfam27, 黑豹模型28 并保留本体术语以匹配序列。 interproscan 的总结果按期望值过滤（E 值 < 10−3），自定义python脚本仅考虑最佳匹配值，结果显示在补充表S2中。构建了一个自定义 python 脚本来执行术语计数和 Blast2go (v5.2) 软件29用于酶委员会编号 (EC) 映射；水解酶 (EC: 3) 映射通过blastp 使用策划的MEROPS (v12.3) 蛋白酶数据库进行分析30, 结果由 Evalue < 10 过滤−3（补充表 S3）。毒力和致病因素分析。注释程序（补充表 S2）的结果通过 python 脚本过滤钙蛋白酶（PF00648；PTHR10183）、木瓜蛋白酶（PF00112；PTHR12411；PTHR35899）、GP63 样（PF01457；PTHR10942）、枯草杆菌蛋白酶样（PF00082）、丝氨酸蛋白酶 (PF05577; PTHR11010)、四跨膜蛋白 (PF00335)、BspA 样蛋白 (PF13306;PTHR45661)、衣原体多态性膜蛋白 (PF02415)、MYB 蛋白 (PF13921;PF00249;PTHR45614)。使用 MUSCLE v3.8.31 算法在 Jalview 软件中进行多序列比对，通过 Jpred 计算二级结构预测32. SignalP v5.0 server 和 TMHMM Server v. 2.0 分别预测信号肽和跨膜结构域35.梅毒螺旋体富含亮氨酸重复 (TpLRR) 模式37, Lx(2)IxIx(3)Vx(2)IGx(2)AFx(2)Cx(2) 被python自定义脚本搜索，允许三个不匹配。预测毒力因子（FPKM 值）的 Spearman 相关系数通过自定义 R 脚本计算并绘制在热图上。凝聚过程和分析。为了减少数据集的冗余，我们执行了层次聚类方法 (UPGMA)，以便通过相似的表达值将 26,927 个转录本分组。为了估计足够数量的集群，我们对不同数量的集群执行了凝聚程序并计算了集群价值的度量（Davies-Bouldin index，DBI）38. DBI 值低表明簇结构良好；结果，我们将 26,927 个转录本分组到 458 个簇中（补充图 S1）。簇组成列于补充表 S2 中，得到的簇矩阵（458 × 3）显示在补充表 S4 中。热图和词云图由 Wolfram 脚本构建，词权重表示为 log2 函数，并绘制高于 2 的值。促销员分析。从 NCBI 基因组数据库 (txid: 1,144,522) 下载 T. fetus K1 菌株的推定启动子序列特征注释的提取。使用bedtools套件从翻译起始的每个T. fetus K1基因中提取上游基因组区域，20个碱基对39.地区是 科学报告|(2022) 12:10057 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14310-x3这部作品猪30/1一个BP-4bG10/1b装配尺寸 (nt)51,862,25047,094,26837,882,42729,525,551重叠群 (n°)26,92843,30842,36336,559最大的21,23717,20314,31417,195最短的71201201201平均1744.381087895.25806.61N502454150312591178地图与 K1 (%)–95.6896.6591.36表格1。胎儿三滴虫转录组统计。这项工作：在这项工作中使用 Tritrichomonas fetus K1 基因组作为参考进行了引导组装。 Map 与 K1 (%) 是指分离读取与本工作中使用的参考的映射率。一个Morin-Adeline 等人的转录组统计摘要； 201518,bMorin-Adeline 等人的转录组统计摘要； 201411.通过自定义 python 脚本扫描阴道毛滴虫转录启动子 (Inr) [TCA] CA [TCA] [TA] 的模式。匹配序列在翻译起始上游扩展至 300 个碱基对，并扫描所得序列的基序 M3 [AGT][AG]C[GC]G[TC]T[TAG]、基序 MRE-1/MRE-2r (TAACGATA )，主题 MRE-2f。 (TATCGT)31和脊椎动物共有 MYB 识别元件 (MRE, [CT] AAC[GT]G)33通过自定义 python 脚本。结果牛、猪和猫 T. 胎儿转录组学概述。我们进行了综合生物信息学方法，以了解致病因子基因表达水平的差异是否可能与 T. fetus 对不同宿主的适应有关。首先，我们使用三个可用的 T. fetus 菌株转录组学数据集进行了映射实验：BP-4（牛）、PIG30/1（猪）和 G10/1（猫）11.我们使用了 T. fetus（牛 K1 分离株）的可用公共基因组17作为参考。我们的结果表明，三种分离株对 T. fetus K1 菌株的映射率很高（表 1），因此，不同分离株在转录组水平上与牛 K1 参考分离株之间存在密切关系。即使可以使用 de novo T. fetus 转录组组装11，据记载，参考引导组装具有以下优势，例如改善重叠群长度和冗余，整合参考基因的注释以及组装非常低