重症成人 COVID-19 患者 SARS-CoV-2 RNA 血症、N 抗原血症和病毒特异性抗体的联合动力学分析

科学报告|(2022) 12:8273| https://doi.org/10.1038/s41598-022-12461-51 打开组合动力学分析重症成人 COVID-19 患者中 SARS-CoV-2 RNA 血症、N 抗原血症和病毒特异性抗体的研究Rosa Costa1,5, Juan Alberola2,5, Beatriz Olea1, Roberto Gozalbo‑Rovira2, Estela Giménez1, Enric Cuevas‑Ferrando3, Ignacio Torres1, Eliseo Albert1, Nieves Carbonell4, José Ferreres4, Gloria Sánchez3, Jesús Rodríguez‑Díaz2, María Luisa Blasco4 &大卫纳瓦罗1,2血浆 SARS-CoV-2 RNA 血症、核衣壳 (N) 抗原血症和病毒特异性抗体的联合动力学分析可能有助于确定抗体在预防 COVID-19 患者病毒传播中的作用。我们使用 RT-PCR 分析、侧流免疫层析法和受体结合结构域 (RBD) 和基于 N 的免疫分析对一组 71 名连续重症 COVID-19 患者（49 名男性；中位年龄，65 岁）进行了这项分析。在症状发作后中位 12 天收集的总共 338 份血浆样本可用于分析。在 26 个（36.5%）和 30 个样本中的 37 个和 43 个样本中检测到 SARS-CoV-2 RNA 血症和 N-抗原血症(42.2%) 患者。游离 RNA 是血浆中发现的 SARS-CoV-2 的主要生物学形式。两种病毒成分的检出率都与上呼吸道的病毒载量有关。检测到 SARS-CoV-2-RBD 抗体的中位时间为症状出现后 14 天（范围，4-38 天）。观察到抗体水平的下降与 RNA 血症和 N 抗原血症水平的增加平行，但总体而言，病毒 RNA 血症和 SARS-CoV-2-RBD 抗体水平之间存在相当适度的负相关（Rho = -0.35；P < 0.001） .这些数据让人怀疑抗体在检查的时间范围内是否主要参与了从血液中清除病毒的过程。SARS-CoV-2 似乎在多种器官和组织中复制，这有助于解释 COVID-19 的多系统性质1.一个似是而非的致病情景是，在呼吸道初始复制后，SARS-CoV-2 越过上皮屏障并通过血流传播，到达肺外部位2.支持这一观点，使用电子断层扫描和免疫染色在 COVID-19 患者的血浆颗粒中鉴定出明显完整的病毒粒子3;然而，从未从血浆样本中培养出 SARS-CoV-24.此外，在 COVID-19 患者中经常检测到病毒 RNA 血症、抗原血症（核衣壳-N 或 Spike-S）或两者兼有，其比率受所用分析方法的敏感性，尤其是疾病严重程度的调节5.在后一方面，已经表明，在 SARS-CoV-2 感染诊断后的前两周内检测到这些病毒成分中的任何一种都与入住重症监护病房 (ICU)、需要有创机械通气、多器官衰竭有关和死亡率5.功能性抗体，尤其是那些表现出病毒中和能力的抗体，可能有助于 SARS-CoV-2 从血液中清除19，从而最大限度地减少病毒传播。如果这一假设成立，感染后相对较早的循环抗体水平可作为不良临床结果的替代标志。在这种情况下，已经发表了关于血清水平之间关系的相互矛盾的数据。1Microbiology Service, Clinic University Hospital, INCLIVA Health Research Institute, Av. Blasco Ibáñez 17, 46010 瓦伦西亚，西班牙。 2西班牙瓦伦西亚瓦伦西亚大学医学院微生物学系。 3 西班牙巴伦西亚 IATA-CSIC 农业化学和食品技术研究所保鲜和食品安全技术系。 4西班牙瓦伦西亚 INCLIVA 健康研究所临床大学医院医疗重症监护室。 5这些作者的贡献相同：Rosa Costa 和 Juan Alberola。电子邮件：david.navarro@uv.es 科学报告|(2022) 12:8273 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12461-52多变的不。 (%)性别男性49 (69.1)女性22 (30.9)急性生理学和慢性健康评估 (APACHE) II 评分< 1014 (19.7)10–1426 (36.6)15–2931 (43.7)合并症糖尿病17 (23.9)哮喘/慢性肺病11 (15.5)高血压32 (45.0)肥胖38 (53.5)慢性心脏病9 (12.6)血管疾病7 (9.8)癌症3 (4.2)血液病3 (4.2)合并症数量一22 (31.0)两个或更多32 (45.0)没有任何17 (24.0)氧合和呼吸机支持有创机械通气63 (88.7)PiO2/FiO2 < 150 毫米汞柱57 (80.2)急性肾功能不全17 (23.9)抗病毒或抗炎治疗瑞德西韦15 (21.1)皮质类固醇70 (98.5)托珠单抗27 (38.0)表格1。重症监护病房入院时研究人群的临床特征。具有中和或未表征功能的抗体以及 SARS-CoV-2 RNA 血症和 N 抗原血症的严重程度3.为了阐明这个问题，我们在这里对来自相对同质的成年 COVID-19 重症患者队列的连续血浆样本中的 SARS-CoV-2 RNA 血症、N 抗原血症和病毒特异性抗体进行了联合动力学分析。为了加强数据解释，我们还试图阐明血液中存在的 SARS-CoV-2 的生物学形式。材料与方法患者和标本。在这项前瞻性观察性研究中，2020 年 10 月至 2021 年 2 月期间连续招募了 71 名重症 COVID-19 患者（49 名男性和 22 名女性；中位年龄，65 岁；范围，21-80 岁）（表 1）。这些患者属于先前报道的队列6，其中两名参与者由于缺乏有关 SARS-CoV-2 抗体的数据而无法纳入本文。在 ICU 入院后每周采集血浆样本，如果可能，通过离心全血 EDTA 管，冷冻保存并取回用于下述分析。前瞻性记录病史和实验室数据。目前的研究得到了医院临床大学 INCLIVA 研究伦理委员会的批准（2020 年 5 月）。所有实验均按照当地相关指南和法规进行。无论是在医院病房还是在入住 ICU 时，都获得了所有参与者的知情同意。通过 RT-PCR 检测鼻咽标本和血浆中的 SARS-CoV-2 RNA。在收到后24小时内通过RTPCR分析收集在3m通用运输培养基（UTM，BeconDcknson，Spaks，MD，USA）中的鼻咽标本（NP）。在使用AppedBosysems™MagMAX™VaPahogenNucecAcdsoaonKs与ThemoScenc™KngFsheFex自动提取进行RNA提取之后，使用TaqPahCOVD19ComboK（ThemoFshe，MS，USA）乐器。在Abbom2000sp平台AbboMoecua上使用AbbomSampePepaaonSysemDNA试剂盒AbboMoecuaDesPanesUSA从血浆400μ中提取核酸，同时进行SARSCoV2RNA扩增如前所述，在m2000平台上使用AbboReaTmeSARSCoV2检测6.发现血浆测定的检测限约为 100 拷贝/ml (95% CI)6.估计了两种标本类型中的 SARS-CoV-2 病毒载量 科学报告|(2022) 12:8273 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12461-53使用 AMPLIRUN®总 SARS-CoV-2 RNA 对照（西班牙格拉纳达 Vircell SA）6，并在整个研究过程中报告为份数/毫升。SARS-CoV-2 RNA 活力 RT-qPCR 测定。使用以前发布的协议24, 血浆样本在 PBS 中稀释 1/10, 在高温下预处理或不预处理 (95 °C, 10 分钟) 然后在 DNA LoBind 管 (Eppendorf ，德国）在轨道振动器（150 rpm）中。然后使用 Maxwell 提取病毒 RNA®RSC 16 仪器和 Maxwell RSC Pure Food GMO 和鉴定试剂盒（Promega，西班牙）并通过靶向 N 基因（N1 序列）的 RT-qPCR 扩增。 SARS-CoV-2 RT-qPCR 阴性血浆样本加标热灭活的 SARS-CoV-2（约 105gc/mL) 用作对照。在这些条件下，PtCl4 处理后未经预处理的血浆中缺乏病毒 RNA 扩增被解释为与样本中存在游离病毒 RNA（不存在活病毒）相容。血浆中 SARS-CoV-2 N 蛋白的检测。侧流免疫层析 (LFIC) 设备 CLINITESTⓇ 如前所述，快速 COVID-19 抗原测试（Siemens，Healthineers，Erlangen，Germany）用于检测和分级血浆样本中的 SARS-CoV-2 N-抗原血症18.该测定的分析灵敏度约为 50 pg/ml18. N 抗原线强度由组中的五名研究人员（RC、BO、EG、IT 和 EA）使用 3‐水平尺度：0，否定结果； 1 , 测试带强度低于控制带 2 , 测试带强度等于或大于控制线18.当反应程度没有达成共识时，以大多数观察员指定的那一项为最后一项。抗体检测免疫测定。SARS-CoV-2-RBD 反应性 IgG 抗体通过内部开发的免疫测定法，使用在 Sf9 昆虫细胞中产生的重组 RBD，按照先前公布的方案进行定量25.化学发光 Abbott Alinity SARS-CoV-2 抗核衣壳蛋白 IgG 测定用于测量（半定量）SARS-CoV-2-N 反应性 IgG。统计方法。使用Fisher精确检验进行分类变量的频率比较。使用 Mann-Whitney U 检验比较中位数之间的差异。感兴趣的变量之间的相关性通过斯皮尔曼等级检验计算。报告了两侧精确的 P 值。 P值<0.05被认为具有统计学意义。使用 SPSS 20.0 版（SPSS，Chicago，IL，USA）进行分析。结果患者的临床特征。患者在出现症状后的中位时间为 8 天（范围为 2-25 天）入住 ICU。大多数患者最终需要机械通气（88.7%）。入住 ICU 的中位时间为 19 天（范围 2-67）。除一名患者外，所有患者都接受了皮质类固醇治疗，而瑞德西韦和托珠单抗分别用于 21% 和 38% 的患者。检测队列中的 SARS-CoV-2 RNA 血症和 N 抗原血症。入住 ICU 后收集的来自 71 名患者（中位数，4 个样本/患者；范围，1-16）的总共 338 份血浆样本可用于分析。 总体而言，这些患者的第一份血浆样本是在症状发作后的中位数 12 天（范围为 3-38 天）抽取的。 在来自 26 个 (36.5%) 和 30 (42.2%) 患者。 由于上呼吸道 (URT) 中病毒复制的程度可能会影响完整病毒颗粒或病毒产物进入血液的途径，我们研究了感染后早期 NPs 中的 SARS-CoV-2 RNA 载量（中位数为 4 天）症状发作后；范围，1-11）与检测病毒 RNA 血症和 N 抗原血症的可能性相关。 71 人中有 51 人在诊断时对 NP 样本中的 SARS-CoV-2 RNA 载量进行了估计，其中 20 人和 22 人在随访期间分别有可检测到的病毒 RNA 血症和 N 抗原血症。 在其余 20 名患者中，要么通过使用 N 抗原检测 LFIC 测试诊断出 SARS-CoV-2 感染，要么无法获得 RT-PCR CT 值。 如图所示。 如图 1 所示，发生病毒 RNA 血症和 N 抗原血症的患者在 NP 中表现出显着更高的病毒 SARS-CoV-2 RNA 载量（P = 0.009 和 P = 0。04，分别）在诊断时。 此外，在第一个阳性 RT-PCR 血浆样本中